液相色譜-串聯質譜檢測飼料中16種氟喹諾酮類藥物

2021-05-25 02:26:50林小貞周婉儀賈曉菲何思聰招鈺娟譚淑鏵

綠色科技 2021年8期

林小貞，周婉儀，賈曉菲，何思聰，招鈺娟，譚淑鏵

(中山市農產品質量安全檢驗所，廣東中山 528437)

1 引言

氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，FQNs)藥物屬第三代喹諾酮類抗菌藥，其抗菌譜進一步擴大，抗菌活性更強，對革蘭氏陽性菌如金色葡萄球菌、鏈球菌及革蘭氏陰性菌等有效，也是獸醫臨床中廣泛應用的抗革蘭氏陽性菌與陰性菌及霉形體的有效抗菌藥。氟喹諾酮類藥物通過抑制細菌DNA的合成來殺滅細菌，屬于殺菌劑，在臨床上應用廣泛，用于治療各種細菌感染，還用于治療支原體、衣原體感染和結核病。因為其具有抗菌譜廣、抗菌作用強、體內分布廣、在體內藥物濃度高、蛋白結合率低、血半衰期長、使用方便、療效良好、藥物不良反應輕微及價格便宜等特點[1]，在獸醫臨床和畜禽水產養殖中被大量應用。

現在市面上的雞、鴨、鵝等畜禽產品基本都是來源于養殖場，養殖產業發展迅速，在這樣的背景下，很多動物的疾病逐漸涌現出來，漸漸的衍生出了含有各類抗菌藥物的飼料。動物在食用了這類飼料后，治療好疾病的同時也在體內產生了大量的藥物殘留，這對人類健康和環境污染都有一定的影響。

目前，測定FQNs的方法有酶聯免疫法[2]、微生物法[3]、高效液相色譜法[4，5]、高效毛細管電泳法[6]、高效液相色譜-串聯質譜法[7～9]等。其中，液相色譜-串聯質譜法具有選擇性好、靈敏度高等優點，能使多種藥物在色譜柱上都有很好的分離效果，因此近年來，高效液相色譜-串聯質譜法在獸藥殘留的檢測分析中被廣泛應用。本方法建立了一種使用液相色譜-串聯質譜儀同時測定飼料中16種氟喹諾酮類藥物的方法，為飼料中的獸物殘留檢測方法提供參考。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與實驗樣品

(1)儀器：Agilent G6495三重串聯四級桿質譜儀(美國Agilent公司)，配Agilent 1290高效液相色譜儀；Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.1×100 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；渦旋振蕩器(德國IKA公司)；高速離心機(3-18KS，德國Sigma公司)；干式氮吹儀(HGC-24A，天津市恒奧科技發展有限公司)；超聲清洗儀；電子天平；除脂分散凈化管(15 mL，安捷倫)；鹽析包(4 g無水硫酸鈉+1 g氯化鈉)；微孔濾膜(0.22 μm)；水為一級用水等。

(2)試劑：吡哌酸、麻保沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙拉沙星、西諾沙星、奧索利酸、萘啶酸、氟甲喹等標準物質；甲酸(色譜純)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙酸乙酯(色譜純)；磷酸氫二鈉(AR500 g)；檸檬酸(AR500 g)；乙二胺四乙酸二鈉(AR500 g)。

EDTA-Macllvaine緩沖溶液(0.1 mol/L，將625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液與1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液混合，再稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉溶解)

(3)樣品：雞配合飼料，攪拌機粉碎處理，置于通風干燥處保存備用。

2.2 標準溶液的配制

分別準確稱取16種氟喹諾酮類藥物標準物質，置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成100 μg/mL的標準儲備液，再將標準儲備液稀釋，配成混合標準溶液，各組分為1 μg/mL。

由于飼料樣品的基質較為復雜，基質會對所檢測的目標化合物存在一定的干擾，所以使用空白基質添加作標準系列曲線，其濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL。

2.3 樣品前處理

稱取樣品2.00 g于50 mL塑料離心管中，加入2 mL EDTA-Macllvaine緩沖溶液，渦旋30 s，再加入10 mL 1.5%甲酸乙腈，渦旋1 min，超聲提取10 min后，10000 r/min離心5 min，上清液轉移至已活化(加入3 mL水活化)的除脂分散凈化管中，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，將上清液全轉移至另一離心管中，加入鹽析包，振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，取2 mL上清液于試管中，于40 ℃下氮氣吹干。用1 mL初始流動相復溶，渦旋震蕩，過0.45 μm濾膜后，上機檢測。

2.4 儀器檢測方法

2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18 2.1×100 mm，2.7 μm；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量1.00 μL；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 分離16種氟喹諾酮藥物的洗脫梯度

2.4.2 質譜條件

電噴霧離子源(AJS ESI)，正離子模式掃描；多反應監測(MRM)，離子溫度：350 ℃；干燥氣流速14 L/min；霧化器壓力30 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min。16種氟喹諾酮藥物的詳細質譜參數見表2，總離子流圖見圖1。

3 結果與分析

3.1 樣品前處理提取方法的優化

飼料的原料來源比較多，包擴大豆、玉米、豆粕、魚粉、雜粕、氨基酸、乳清粉、肉骨粉、油脂、谷物、飼料添加劑等十余個品種的飼料原料，因此在檢測獸藥殘留的過程中，干擾物質較多，所以選擇一種比較好的提取液尤為重要，本實驗分別比較了1.5%甲酸的乙腈溶液、乙酸乙酯、1%甲酸甲醇3種提取液，圖2為3種提取液的回收率比較，實驗結果顯示1.5%乙酸的乙腈溶液提取效果較好。

3.2 質譜條件的優化

分別在正、負離子模式下對16種氟喹諾酮類藥物進行掃描，發現在正離子模式下響應強度更強。在甲醇-0.1%甲酸水溶液(80∶20，V∶V)等度流動相條件下，采用MassHunter Optimizer(自動參數優化軟件)進行優化，確定母離子和子離子，優化CE電壓。

3.3 色譜條件的優化

實驗比較了甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時待測化合物的峰型和響應值，實驗表明在以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時各種藥物的峰型優于另外兩種流動相條件，且響應值也略高于其他兩種流動相下的響應值，因此，本實驗采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

表2 16種氟喹諾酮藥物殘留測定的值質譜測定條件參數

3.4 方法學驗證

3.4.1 標準曲線和檢出限

方法采用空白基質添加的方法作標準曲線，其濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL，通過定量軟件分析得出16種藥物的標準曲線與其線性回歸方程(表3)。結果表明，16種氟喹諾酮類藥物的標準曲線有較好的線性關系。樣品的檢出限以3倍信噪比計算，得到16種化合物的檢出限范圍為0.035～1.127 μg/kg，滿足國內和國際對氟喹諾酮類藥物殘留監控的要求。

3.4.2 回收率和精密度

為確保方法的可行性，對空白飼料進行3個濃度水平的添加，并且分別做6個平行樣品，同時做空白對照，分析結果見表4。