多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織BMP-15及子宮內(nèi)膜Glycodelin-A的表達*

李云秀 官潔 馬蕊 徐永芳 鐘蘭萍 俞健梅

(云南省第一人民醫(yī)院·昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是育齡婦女中最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，主要表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或無排卵和高雄激素血癥，是無排卵性不孕的主要原因，而懷孕后流產(chǎn)率高達20%～50%，是正常女性的3～10倍[1]。研究認為與PCOS卵子質(zhì)量、代謝異常和子宮內(nèi)膜容受性下降有關(guān)[2-3]。本研究擬通過檢測PCOS大鼠卵巢組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(bone morphogenic proteins 15，BMP-15)以及子宮內(nèi)膜表達的糖蛋白因子Glycodelin-A(GdA)，分析PCOS卵泡發(fā)育異常及子宮內(nèi)膜容受性下降的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇21日齡SD雌性大鼠(21日齡大鼠斷乳，進入性發(fā)育期，至42日齡性發(fā)育成熟)共75只，體質(zhì)量(53.8±9.2)g，購自南京東極生物科技，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗室，清潔級飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～23 ℃，濕度40%～60%，每日光照12 h，自由飲水，喂以標準大鼠顆粒飼料。

1.2 主要試劑、儀器 脫氫表雄酮(DHEA)針劑(上海麥克林生化科技公司)，全自動生化分析儀器(美國Beckman Coulter公司)，BMP-15及FSHR抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(美國Abcam公司),孕馬血清(PMSG)(赤峰博恩藥業(yè))，Gd-A和LIF 酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(上海雙贏生物科技公司)，Gd-A和LIF抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(美國Abcam公司)。

1.3 分組及PCOS大鼠模型構(gòu)建 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后于23日齡開始造模，隨機分為正常對照組(對照組)25只和PCOS模型組(PCOS組)(50只，按照標準化動物實驗最低動物例數(shù)，每組不少于25例，考慮有PCOS大鼠建模失敗可能，故PCOS組大鼠為對照組大鼠數(shù)量2倍)。兩組大鼠體重、空腹血糖(FBG)、血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕激素(P)，促卵泡生長激素(FSH)、促黃體生成素(LH)及空腹胰島素(FINs)無明顯差異(表1)。對照組大鼠每日頸背部皮下注射0.2 mL注射油劑；PCOS組大鼠每日頸背部皮下注射DHEA6 mg/100 g體重+0.2 mL注射油劑共21天。兩組大鼠在用藥后10 d，每天陰道涂片，觀察動情周期變化，共觀察10 d，當(dāng)模型組大鼠無規(guī)律動情周期出現(xiàn)，陰道脫落細胞呈持續(xù)動情間期表現(xiàn)，PCOS大鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 方法

1.4.1 激素和血糖測定 兩組大鼠在注藥的第20天(42日齡)晚8 時開始禁食，于注藥的第21日晨稱重,獲取鼠尾血清2～3 mL，離心后采用全自動生化分析儀測定大鼠血清FSH、 LH、E2、P、T、FBG、FINs濃度。

1.4.2 卵巢組織HE染色及免疫組化染色 PCOS組10只，對照組5只于注藥后21天處死獲取雙側(cè)卵巢稱重，觀察卵巢大體解剖情況，并測量雙側(cè)卵巢的長/寬/高，根據(jù)橢圓形體積公式計算卵巢的體積(mL)=0.5×長(cm)×寬(cm)×高(cm)，文中提及的卵巢體積和卵巢重量均為左、右卵巢之和。用刀片經(jīng)卵巢中軸切下部分卵巢組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成2 um厚的切片，按照常規(guī)HE染色制片，光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)改變。采用BMP-15及FSHR抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒進行免疫化染色，操作方法按試劑盒說明。陽性染色為棕黃色，每個組織點隨機選取3個完整而不重疊的高倍鏡視野(400×)，應(yīng)用Image pro plus 6.0圖像分析軟件，測定每個視野下陽性反應(yīng)的積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)，以每例3個視野的積分光密度平均值作為該組織點的IOD測量值。

表1 兩組大鼠基礎(chǔ)情況比較

1.4.3 子宮內(nèi)膜容受性觀察 將余下的PCOS組大鼠40只，對照組大鼠20只繼續(xù)飼養(yǎng),觀察每天陰道脫落細胞是否有動情周期恢復(fù)，觀察兩周后誘導(dǎo)排卵：注射20 IU孕馬血清(PMSG)，48 h后注射HCG20 IU，當(dāng)日雌雄大鼠，按2∶1和籠。次日檢查有陰道栓者認為受孕，為受孕第一天。分別于受孕第3、5、7、9日，分四批處死大鼠獲取子宮，用2 mL生理鹽水沖洗宮腔獲得沖洗液，以3000 rpm離心10 min，獲取上清液，收集于1.5 mL EP 管中，保存于-20 ℃冰箱，ELISA方法測定沖洗液中Gd-A和LIF的濃度。剖開宮腔，獲取無胚胎附著的子宮內(nèi)膜組織用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成2 μm厚的切片，進行免疫組化染色，采用Gd-A和LIF抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒進行免疫化染色。同法測定Gd-A和LIF在子宮內(nèi)膜不同時期陽性表達的IOD值。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況、血清性激素水平及胰島素抵抗的評估比較 注藥21天后PCOS組和對照組大鼠均發(fā)育良好，體毛潤澤，攝食及行為無明顯差異，反應(yīng)靈活，PCOS大鼠體重(82.97±14.54)g顯著小于對照組(115.08±17.05)g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PCOS組大鼠血清FSH、LH、P、T、FBG、FINS水平均高于對照組(P<0.05)，E2低于對照組(P<0.05)。PCOS組大鼠存在胰島素抵抗和高雄血癥。見表2。

表2 兩組激素水平比較

2.2 兩組卵巢組織學(xué)改變比較 PCOS組大鼠的卵巢表面蒼白，隱約可見包膜下擴張的卵泡，對照組大鼠的卵巢表面色澤紅潤，飽滿。PCOS組大鼠卵巢體積(0.05±0.004) mL及重量(50.97±17.29) mg均低于對照組[(0.066±0.006) mL，(69.89±19.21) mg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HE染色光鏡下見PCOS組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)各級發(fā)育期卵泡及黃體少見，卵泡多呈囊性擴張，卵泡內(nèi)卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞層數(shù)減少(多為2～3層)，排列疏松；卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞增生。對照組大鼠卵巢鏡下見發(fā)育各個時期的卵泡和黃體；顆粒細胞形態(tài)完整，排列整齊，多為8～9層，卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞未見增生。見圖1。

圖1 PCOS組和對照組卵巢HE染色

2.3 兩組卵巢BMP-15和FSHR表達比較 PCOS組大鼠的卵巢BMP-15和FSHR光鏡下觀察陽性表達明顯弱于對照組(圖2)。BMP-15和FSHR陽性反應(yīng)IOD測量值PCOS組(980.91±65.51；1070.12±54.18)明顯低于正常對照組(4919.72±460.13；5743.66±311.19)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 PCOS組和對照組卵巢BMP-15和FSHR免疫組化染色

2.4 兩組子宮內(nèi)膜容受性改變比較 PCOS組大鼠飼養(yǎng)兩周，陰道脫落細胞觀察未出現(xiàn)動情周期，而對照組大鼠的動情周期為(5.1±1.4)d。給予孕馬血清誘導(dǎo)排卵，在受孕后不同時間順序觀察Gd-A和LIF在子宮腔內(nèi)沖洗液濃度變化及在子宮內(nèi)膜的表達。在光鏡下觀察子宮內(nèi)膜免疫組化染色情況，可見隨時間的增加，對照組子宮內(nèi)膜逐漸變厚，腺體增生擴張明顯，細胞增大，其內(nèi)分泌空泡明顯增多，同時Gd-A和LIF陽性染色細胞數(shù)也是逐漸增加(圖3)，IOD值測定兩者呈同步上升趨勢。而PCOS組子宮內(nèi)膜增生不明顯，腺體增生不明顯，分泌空泡少見，同時Gd-A和LIF陽性染色細胞數(shù)較少，隨時間推移陽性細胞增加不明顯(圖4)，IOD值未見明顯改變，與同期對照組比較有顯著性差異(P<0.05)(表3)。宮腔沖洗液Gd-A和LIF濃度變化也是類似結(jié)果，見表4。

3 討論

PCOS是育齡婦女中最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，主要表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或無排卵和高雄激素血癥，同時集合了一組多樣的多系統(tǒng)的慢性內(nèi)分泌紊亂，包括胰島素抵抗(RI)，糖代謝異常、脂代謝異常等[4]。高雄激素在PCOS的發(fā)病及內(nèi)分泌紊亂中起到至關(guān)重要的作用[5]。本研究采用雄激素誘導(dǎo)成功構(gòu)建了PCOS大鼠模型，大鼠卵泡出現(xiàn)多囊樣改變，各級發(fā)育卵泡及黃體少見同時伴激素異常及胰島素抵抗。PCOS的卵泡發(fā)育異常表現(xiàn)為大量卵泡發(fā)育至5 mm時停滯，竇卵泡數(shù)是卵巢功能正常者的2～3倍[6]，PCOS存在卵泡成熟障礙，但機制并不完全清楚。隨著BMP-15、生長分化因子-9(GDF-9)等卵母細胞源性生長因子的發(fā)現(xiàn)及對其功能的深入研究，卵母細胞自分泌及調(diào)控在卵泡成熟中的關(guān)鍵作用越加受重視，認為PCOS卵泡發(fā)育障礙與之密切相關(guān)[7]。BMP-15是TGF-β超家族的主要成員之一，目前的研究表明其僅存在于哺乳動物的卵巢中，由卵母細胞表達合成。在人類始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡以及成熟卵泡的發(fā)育過程中均有表達，在整個卵泡發(fā)育過程中都有重要作用[8]，是促卵母細胞生長、抑制顆粒細胞凋亡的重要因子[9-10]。同時認為其為黃體化抑制劑，避免卵母細胞過早排出機體，核質(zhì)成熟不同步，對卵子的成熟及優(yōu)質(zhì)卵子的形成有重要作用[11-13]，魏莉娜等[14]發(fā)現(xiàn)BMP-15蛋白在PCOS卵泡發(fā)育的早期階段表達水平降低、滯后。動物實驗發(fā)現(xiàn)BMP-15雜合突變的羊卵泡發(fā)育停滯在初級卵泡階段，而穩(wěn)定濃度(200 ng/mL)的重組BMP-15蛋白可以促進竇前卵泡、竇卵泡發(fā)育[15]。本研究顯示，PCOS模型大鼠卵巢BMP-15表達明顯低于正常，同時FSHR也低于正常，由此推測，PCOS患者卵巢局部BMP-15表達下降，抑制了原始卵泡的啟動和初級卵泡的發(fā)育，同時對FSH的反應(yīng)性減低，進一步影響了PCOS卵泡的發(fā)育成熟。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵母細胞BMP-15合成異常可以引發(fā)凋亡相關(guān)因子 BAX、BCL-2 異常表達增加卵丘細胞凋亡率[16]。并且原發(fā)性卵巢功能不全(POI)也與BMP-15表達下降有關(guān)[8]。因此BMP-15表達異常在不同疾病中可能存在不同的調(diào)節(jié)機制，所以BMP-15對卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)機制值得進一步研究。

圖3 不同時間兩組子宮內(nèi)膜LIF的表達

圖4 不同時間兩組子宮內(nèi)膜Gd-A的表達

表3 兩組不同時間子宮內(nèi)膜LIF和Gd-A的表達

表4 兩組不同時間子宮腔沖洗液LIF和Gd-A的比較

影響子宮內(nèi)膜容受性的研究中，很多種因子參與了子宮內(nèi)膜容受的調(diào)控。眾所周知的有雌孕激素以及其在子宮內(nèi)膜的受體、白血病抑制因子(LIF)，整合素,妊娠相關(guān)蛋白Glycodelin[17]。Glycodelin 是一類具有再生能力的組織中及一些腫瘤組織合成的糖蛋白，子宮內(nèi)膜合成的Glycodelin因其最初是在羊水(amniotic fluid)中發(fā)現(xiàn)而被稱為Glycodelin- Amniotic (Gd-A)。Gd-A 是由分泌期和蛻膜樣子宮內(nèi)膜腺體的上皮細胞合成，大部分分泌到子宮腔內(nèi)，小部分釋放到周圍循環(huán)中。在有規(guī)律月經(jīng)周期,Gd-A通常于排卵后的4～5 d或出現(xiàn)促黃體生成素，峰值后5～6 d((此時正為胚胎種植窗))出現(xiàn)在一些子宮內(nèi)膜腺體中,宮腔沖洗液和血清中可以檢測到Gd-A,至排卵后10 d即分泌晚期所有的子宮內(nèi)膜腺體均有表達,Gd-A分泌達到峰值,血Gd-A濃度超過基礎(chǔ)值300倍以上,此時子宮沖洗液中Gd-A濃度是血清濃度的100倍左右。峰值持續(xù)到下次月經(jīng)來潮的第一天,然后迅速下降,至月經(jīng)第7天降到基礎(chǔ)狀態(tài)，而一旦妊娠胚胎著床后其合成迅速增加[18-19]。近年來研究表明， Gd-A是一種免疫抑制性蛋白，它能抑制自然殺傷免疫細胞( NK) 的免疫活性并減低Th1/Th2比值[20-22]，說明其在胚泡的成功植入及正常妊娠的維持有重要意義。因此根據(jù)Gd-A在子宮內(nèi)膜的規(guī)律性表達，黃體中晚期子宮沖洗液Gd-A的濃度可以作為一種評價子宮內(nèi)膜功能的無創(chuàng)性檢查方法。LIF已被證明是胚胎著床的必要因子, 且與植入時間緊密相連, 在胚胎著床中起重要調(diào)節(jié)作用, 是著床窗口開放所必需的細胞因子[23]。因此本研究將Gd-A納入評價PCOS子宮內(nèi)膜容受性的研究指標并與LIF做對比，客觀分析Gd-A在評價子宮內(nèi)膜容受性中的意義。本研究結(jié)果提示，在正常大鼠中，隨著孕期增加Gd-A與LIF同步增加，相比之下PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜Gd-A和LIF隨孕期延長并未見明顯增加，說明PCOS在內(nèi)分泌紊亂的狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜的容受性受到影響，導(dǎo)致PCOS妊娠率下降并且流產(chǎn)率增加。對于PCOS或不孕患者子宮內(nèi)膜容受性無創(chuàng)性的評估主要有B超下內(nèi)膜的厚度及相關(guān)血流動力學(xué)參數(shù)評估，血清雌孕激素測定，可以間接反映子宮內(nèi)膜容受性[24-26]。本研究采用宮腔沖洗液測定Gd-A和LIF濃度評估子宮內(nèi)膜容受性，發(fā)現(xiàn)Gd-A和LIF同步增加，并與子宮內(nèi)膜腺體表達有一致性，相比之下宮腔沖洗液Gd-A濃度明顯高于同期LIF濃度，變化幅度更加明顯，更有利于比較觀察，因此采用宮腔沖洗液Gd-A可以作為評價子宮內(nèi)膜容受性的無創(chuàng)性檢查并可以動態(tài)觀察，了解內(nèi)膜內(nèi)分泌狀態(tài)，具有較高臨床應(yīng)用前景。然而我們還需要進行大樣本的臨床研究確定子宮腔沖洗液Gd-A濃度的界值，使其具有實際臨床應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

PCOS卵母細胞BMP-15表達異?？赡苁荘COS卵泡發(fā)育障礙的原因之一，卵巢局部微環(huán)境的調(diào)節(jié)失衡是 PCOS 患者卵泡發(fā)育異常的重要因素。同時PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的容受性指標Gd-A和LIF均低于正常，提示PCOS低妊娠率和高流產(chǎn)率與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)。