MTHFR、MTRR基因多態性與不良妊娠結局的相關性

潘銀平 馬欣 黨莉婷 蔣艷麗

(1.西北婦女兒童醫院產科，陜西 西安 710000；2.空軍軍醫大學唐都醫院婦產科，陜西 西安710038)

不良妊娠結局是指正常妊娠以外所有的病理妊娠及分娩期并發癥，包括早產、妊娠糖尿病、死胎及流產等，并對孕產婦及胎兒產生嚴重不良影響[1]。因此探究不良妊娠結局的發病機制對防治不良妊娠結局的發生極其重要。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)全稱為5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，位于人1號染色體1p36.3位置[2]。研究發現，MTHFR基因C667T位點變異與胚胎停止發育有關[3]。甲硫氨酸合成還原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)基因定位于人類染色體5p15.2-15.3，最常見的突變為A66G，該突變導致MTRR活性降低，進而造成同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝受阻，引起高Hcy血癥，高Hcy血癥與自然流產、妊娠高血壓、胎兒宮內發育遲緩等有關[4-6]。同時，MTHFR、MTRR還是葉酸和Hcy代謝的關鍵酶，其基因型在不同國家和地區呈多態性分布[7-8]。研究顯示，孕婦體內葉酸水平與妊娠結局密切相關，葉酸缺乏可導致神經管畸形、胎盤早期剝離和早產等風險升高[9-10]。因此本研究通過檢測發生不良妊娠結局孕婦血漿中MTHFR、MTRR基因的多態性，探究二者與不良妊娠結局的關系，以期為臨床防治不良妊娠提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月～2018年6月因不良妊娠于西北婦女兒童醫院接受治療的有不良妊娠史的88例孕婦作為研究對象(不良妊娠組)，年齡24～40歲，平均年齡(28.64±3.56)歲。另選取同期在本院做產前檢查結果正常的無不良妊娠結局史的孕婦95例作為對照組，年齡23～40歲，平均年齡(28.12±3.24)歲。納入標準：①年齡22～40歲的女性。②不良妊娠組孕婦均有既往不良妊娠結局史，如先兆流產、早產等。③對照組孕婦均無過往不良妊娠結局史。④具備詳細的臨床病歷資料。排除標準：①孕婦或其丈夫有染色體異常疾病。②伴隨有嚴重妊娠高血壓、心臟病等基礎性疾病。③患有多囊卵巢綜合征、子宮畸形等疾病。④患有嚴重心、肺、肝、腎等功能不全者。本研究患者及家屬知情并簽署知情同意書，且經本院道德倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑和儀器 全血基因組DNA快速抽提試劑盒(美國OMEGA公司)，Taq DNA聚合酶(貨號68N25)、dNTP(貨號NQ2056)、600bp DNA ladder (貨號SM0321)、限制性內切酶Hnif Ⅰ(貨號FD0585)、Sma I(貨號FD0596)均購自賽默飛世爾生物科技有限公司，低溫高速離心機(型號FC5714)購自奧豪斯國際貿易有限公司，-80 ℃超低溫冰箱(型號MDF-86)購自安徽中科都菱商用電器股份有限公司，PCR分析儀(型號ABI7500)購自北京智杰方遠科技有限公司，引物由上海英駿生物工程公司合成并提供。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA提取及擴增 待孕婦生產前，收集兩組研究對象空腹靜脈血5 mL于抗凝管中置-80 ℃冰箱保存待用。經常規解凍后采用全血基因組DNA快速抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，嚴格按照操作說明書進行。PCR擴增反應體系：滅菌雙蒸水14.2 μL，10×PCR緩沖液2 μl，dNTP 1.6 μL，正向引物與反向引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s，以上三個步驟循環35次，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取出離心備用，對產物進行純化。采用限制性內切酶Hnif Ⅰ、Sma Ⅰ酶切鑒定。酶切反應體系：10×Buffer 1.5 μL, 0.1×BSA 1.5 μL，Hnif Ⅰ、Sma I 0.8 μL，PCR產物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應體積15 μL。反應條件：37 ℃下溫浴2 h，10 × Buffer 1.5 μL終止反應。酶切產物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，采用凝膠成像系統分析單核苷酸多態性基因型結果。MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點引物序列見表1。

1.3.2 觀察指標 ①兩組MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點多態性分析比較。②記錄并比較不良妊娠組患者妊娠結局情況，包括胎兒宮內生長受限(Intrauterine growth restriction，IUGR)、胎死宮內、胎兒畸形及早產兒情況。

表1 Taqman-MGB探針所在位置

1.4 統計學分析 采用統計學軟件SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA，2011)進行數據分析，符合正態分布的計數資料以率(%)表示，組間比較采用2檢驗；采用Hardy-Weinbery平衡檢測平衡程度。Logistic回歸分析不良妊娠結局的影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點基因多態性MTHFR基因C677T位點基因型包括：只有152 bp的野生純合型(CC基因型)；既有152bp又有98 bp、54 bp片段的是突變雜合型(CT基因型)；包含98 bp和54 bp的突變純合型(TT基因型)。MTRR基因A66G位點基因型包括：僅有372bp的野生純合型(AA基因型)；既有372bp又含有209bp及163bp的突變雜合型(AG基因型)；包含209bp及163bp的突變純合型(GG基因型)，見圖1。

圖1 MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點基因多態性

2.2 Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 根據Hardy-Weinberg平衡定律，對照組與不良妊娠組MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點各基因型的期望值和觀察值進行2檢驗，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性,見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果(n)

2.3MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點多態性分析 與對照組相比，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高(P<0.05)；MTRR基因A66G位點AG、GG及G等位基因頻率顯著升高(P<0.05)，見表3、表4。

2.4MTHFR基因C677T位點、MTRR基因A66G位點與不良妊娠結局關系MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子TT型及MTRR基因A66G位點野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型患者IUGR、胎死宮內、胎兒畸形、早產兒發生率均依次升高，三組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表5、表6。

2.5Logistic回歸分析不良妊娠結局的影響因素 以是否發生不良妊娠結局為因變量，以MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型為自變量進行二元logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點雜合子AG型、純合子GG型是不良妊娠結局發生的危險因素(P<0.05)，見表7。

表3 MTHFR基因C677T位點多態性分析[n(×10-2)]

表4 MTRR基因A66G位點多態性分析[n(×10-2)]

表5 MTHFR基因C677T位點與不良妊娠結局關系[n(×10-2)]

表6 MTRR基因A66G位點與不良妊娠結局關系[n(×10-2)]

表7 Logistic回歸分析不良妊娠結局的影響因素

3 討論

不良妊娠結局包括早產、胎死宮內、胎兒畸形等疾病，并對孕婦和胎兒產生嚴重不良影響。因此，妊娠早期識別這類高危妊娠將有助于臨床進行預防性控制，降低不良妊娠結局的發生率。近年來，葉酸及Hcy水平等影響孕婦妊娠結局的物質受到越來越多的關注，而MTHFR及MTRR基因多態性對葉酸和Hcy的代謝具有重要的影響[3,5]。

MTHFR是調節半胱氨酸和四氫葉酸代謝的關鍵酶，其C677T位點突變是胞嘧啶(C)向胸腺嘧啶(T)轉化，導致MTHFR多肽中的纈氨酸取代了丙氨酸，使MTHFR活性降低約34%～75%[11-12]。MTRR基因A66G位點突變，導致異亮氨酸被蛋氨酸取代，該位點突變后使甲基維生素B12生成減少，引起血清Hcy的水平升高[13]。林寧等[14]研究發現，中國江蘇部分地區孕前女性人群中存在MTHFR基因C677T位點突變，孕婦體內出現高Hcy和低葉酸的現象。研究認為Hcy可能參與先天性心臟病發病機制中，其代謝異常是誘發先天性心臟病的一個獨立危險因素[15]。研究顯示，與正常孕婦相比，妊娠期高血壓患者血清Hcy水平升高，經規范化補充葉酸后，血清Hcy降低[16]；妊娠糖尿病胰島素抵抗患者血清Hcy水平升高，與胰島素抵抗指數呈正相關[17]，表明MTRR基因A66G位點突變導致的血清Hcy水平升高可能對妊娠期孕婦有較大影響。本研究發現，與對照組相比，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高；MTRR基因A66G位點AG、GG及G等位基因頻率顯著升高，提示C677T及A66G突變可能與不良妊娠有關。

本研究發現，不良妊娠組MTHFR基因C677T位點攜帶T等位基因突變、MTRR基因A66G位點攜帶G等位基因突變的不良妊娠結局發生率顯著高于無T和G突變的孕婦。進一步分析發現，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型及MTRR基因A66G位點雜合子AG型、純合子GG型是不良妊娠結局發生的危險因素。提示MTHFR及MTRR基因多態性與不良妊娠結局的發生密切相關。

4 結論

MTHFR基因C677T位點存在野生CC型、雜合子CT型、純合子TT型，MTRR基因A66G位點存在野生AA型、雜合子AG型、純合子GG型，MTHFR基因C677T位點及MTRR基因A66G位點多態性與不良妊娠結局的發生有關，是不良妊娠結局發生的危險因素。本研究也存在地區、人群的限制，今后可以擴大研究范圍，進一步驗證MTHFR及MTRR基因多態性與不良妊娠結局的關系。