miR-204-5p對卵巢早衰大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的調控機制*

董小敏 李睿 楊進 李娜

(1.咸陽市中心醫院檢驗科，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市中心醫院生殖醫學科，陜西 咸陽 712000；3.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 571199)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性在40歲前由于某種原因出現卵巢功能衰竭，進而出現閉經、雌激素紊亂等癥狀的婦科疾病[1]。臨床調查顯示，POF發病率約為1%～3%，近年來隨著我國女性生活壓力的不斷增加，POF發病率逐年升高，給女性身心健康造成嚴重影響[2]。目前，臨床常采用激素替代或促排卵等方法治療POF，但不良反應較多，復發率高，且可增加卵巢癌發生風險。研究顯示，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在抑制卵巢顆粒細胞凋亡、修復受損卵巢組織方面發揮積極作用，且BMSCs易于獲得，在干細胞治療領域成為研究熱點[3-4]。近年來研究表明，POF卵巢組織與正常卵巢組織間存在多種差異表達的微小RNA(microRNA，miRNA)，其中miR-204-5p是表達上調最多的miRNA之一，在調節卵巢功能、雌激素分泌等方面發揮重要作用[5]。研究報道，轉染miRNA的BMSCs可提高抑制后細胞的存活能力，進而改善治療效果[6]。目前，關于miR-204-5p對POF卵巢顆粒細胞凋亡調控機制方面研究尚少，本研究將穩定轉染低表達miR-204-5p的BMSCs注射至POF大鼠，評估沉默miR-204-5p及聯合BMSCs對POF大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，并初步探討影響機制，為臨床POF治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取SPF級雌性Wistar大鼠，6周齡，體質量180～200g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號:SCXK(京)2019-0008，使用許可證號:SYXK(京)2019-0022。飼養條件為(26±2)℃恒溫、40%～60%濕度、12 h/12 h明暗交替環境中，自由飲水和進食。實驗開始前所有大鼠均進行陰道脫落細胞涂片檢查，篩選動情周期正常的75只大鼠進行后續實驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 含有大鼠miR-204-5p基因反義寡核苷酸序列(rno-ASO-miR-204-5p)的重組慢病毒載體(pLVX-shRNA2)，即LV-rno-ASO-miR-204-5p(由上海英駿生物技術有限公司測序及慢病毒包裝)，病毒滴度為1×109/mL。注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，10 mg，批號H37021472)，逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)，兔抗鼠絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、B細胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease-3，Caspase-3)單抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(美國Abcam公司)；Elecys2010全自動化學發光分析儀(美國羅氏公司)，RM2235徠卡切片機(德國徠卡顯微系統貿易公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，CheniDoc XRS化學發光成像分析系統(Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs分離培養及鑒定 取3只大鼠脫頸處死，浸泡于75%酒精中，分離脛骨和股骨，注射器吸取含10%胎牛血清、100U/mL青鏈霉素的DMEM完全培養基，反復沖洗骨髓腔，獲取骨髓腔細胞單細胞懸液，以體積比1∶1加入Percoll分離液，于2500 r/min離心3 min，離心半徑10 cm，取中間層單個核細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)洗滌2次后，用完全培養基調整細胞密度為1×106/mL，接種至細胞培養皿，細胞貼壁融合至75%左右進行傳代，取第3代細胞進行流式細胞術鑒定細胞免疫表型。取第3代細胞，胰蛋白酶消化后重新接種，待細胞再次融合至80%時，分別加入成骨、成脂肪、成軟骨誘導液，后每2～3天換液1次，誘導培養至14 d，分別進行茜素紅染色、油紅O染色及阿利新藍染色觀察。取符合BMSCs生物學特征的細胞進行后續實驗。

1.2.2 重組慢病毒轉染BMSCs 取第3代BMSCs細胞重新接種至96孔板，再次融合70%左右時，加入感染復數(multiplicity of infection，MOI)為20的慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p，繼續培養24 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，獲得穩定轉染的BMSCs細胞用于后續實驗。

1.2.3 模型制備、分組及干預 選取動情周期正常的75只大鼠，隨機分為對照組、POF組、BMSCs組、shRNA組、shRNA-BMSCs組，每組各15只。除對照組外，其余各組參照文獻[7]制備大鼠卵巢早衰(POF)模型：每周于同一時間以6 mg/kg體質量腹腔注射0.5 mg/mL的順鉑生理鹽水溶液(對照組注射等量生理鹽水)，每周注射1次，連續2周，注射后每天進行陰道涂片，監測動情周期變化，動情周期紊亂則造模成功。取造模成功大鼠(本實驗均造模成功)，于第2次注射順鉑7d后，shRNA組分別向雙側卵巢各注射4×107TU的慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p，BMSCs組、shRNA-BMSCs組分別向雙側卵巢各注射2×106個BMSCs細胞及穩定轉染LV-rno-ASO-miR-204-5p的BMSCs細胞，對照組和POF組注射生理鹽水。

1.2.4 動情周期監測及標本采集 完成順鉑注射后第14～28天，每天早上8∶00進行陰道脫落細胞涂片檢查，監測動情周期恢復情況。干預前1 d及干預后(注射慢病毒載體、BMSCs、轉染慢病毒載體的BMSCs后)28 d，各組大鼠尾靜脈采血1 mL，室溫靜置分層后，2800 r/min(離心半徑10 cm)，留取上層血清，置于-80 ℃保存備用。血樣采集完畢脫頸處死大鼠，剖腹取雙側卵巢組織，右側放置于40%中性甲醛中固定備用，左側放置于-80 ℃保存備用。

1.2.5 FSH、E2水平檢測 取保存于-80 ℃的血清樣品，分別采用化學發光法，于全自動化學發光分析儀及配套試劑盒檢測血清FSH、E2水平。

1.2.6 觀察卵巢形態 取保存于40%中性甲醛中的卵巢組織，酒精梯度脫水后進行石蠟常規包埋，制作厚度為5 μm的連續切片，取切片進行二甲苯脫蠟、酒精水化步驟，進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色法染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察卵巢形態，參照Gougeon計數各級卵泡數量，包括始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡。

1.2.7 顆粒細胞凋亡檢測 取卵巢組織切片，二甲苯脫蠟、酒精水化，洗滌后晾干，按照TUNEL試劑盒說明書檢測卵泡顆粒細胞凋亡情況：室溫下每張切片滴加蛋白激酶K處理25 min，然后滴加50 μL TUNEL檢測液(含TdT酶5 μL、dUTP 45 μL),避光37 ℃孵育60 min，PBS洗滌后滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，避光37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，進行DAB顯色5～10 min，PBS洗滌后進行蘇木素復染3～5 s，立即自來水沖洗，自然晾干后中性樹膠封片，光鏡下觀察卵泡顆粒細胞凋亡情況，以棕黃色或黃色染色為凋亡細胞，隨機取5個視野，計數100個卵泡顆粒細胞中凋亡細胞數，計算顆粒細胞凋亡率(100個卵泡顆粒細胞中凋亡細胞數)。

1.2.8 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達檢測 取-80 ℃保存的卵巢組織75 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉錄獲得互補鏈cDNA模板，進行基因序列擴增，按照RT-qPCR SYBR II試劑盒說明書設定反應體系，反應條件設置為95 ℃預變性4 min；重復40個循環(95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s)，72 ℃再次延伸5 min。miR-204-5p以U6為內參對照，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3以GAPDH為內參對照，2-ΔΔCT法計算待測基因相對表達強度。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9 MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達檢測 取-80 ℃保存的卵巢組織50 mg，液氮研磨并轉至離心管中，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，12000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，BCA法進行蛋白定量，取50 μg待測樣本與等量上樣緩沖液混勻后，沸水浴10 min，12000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，取上清液，進行12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉儀將條帶轉移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠一抗稀釋液[MAPK、Bcl-2、Bax(1∶1000)，Caspase-3(1∶500)]，4 ℃搖床孵育過夜，PBST洗滌3次×8 min，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10000)，室溫孵育1 h，暗室中顯影，凝膠成像系統掃描分析條帶灰度值，以目的條帶與內參β-actin條帶灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計數資料以率(%)表示，組間比較采用2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，重復計量資料比較采用重復測量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗；多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs培養、鑒定 BMSCs原代培養1 d后換液，細胞開始貼壁生長，呈多角形或梭形，培養至第3天可見細胞集落樣生長(圖1A)，繼續培養至第5天后細胞開始快速增殖(圖1B)，培養至第7天細胞融合至90%以上，呈螺旋狀或纖維樣排列(圖1C)，傳代后細胞均勻分布，增殖迅速，約3～4天可傳代1代，傳至第3代細胞形態無明顯變化(圖1D)。將培養第3代BMSCs細胞進行流式細胞術檢測，結果顯示，細胞表面標記物CD90、CD44陽性率92%以上，CD34、CD11b陽性率1.25%以下，符合BMSCs表面標志物特征(圖2)。將培養第3代BMSCs細胞進行成骨誘導分化14 d茜素紅染色可見大量紅色鈣結節(圖3A)，成脂肪誘導分化14 d油紅O染色可見紅色球形油脂滴(圖3B)，成軟骨誘導分化14 d阿利新藍染色可見藍色酸性粘多糖(圖3C)。細胞形態學、表面標志物及三系分化鑒定均符合BMSCs生物學特征，可用于后續實驗。

圖1 BMSCs原代及傳代培養

2.2 miR-204-5p轉染效率觀察 慢病毒載體LV-rno-ASO-miR-204-5p感染第3代BMSCs細胞24 h后，于熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達，傳代后熒光強度仍未見明顯減弱，轉染效率均大于90%，可用于后續實驗研究，見圖4。

2.3 大鼠一般情況及動情周期恢復情況觀察 干預后對照組大鼠活動量、飲食均正常，體毛光滑有光澤，動情周期均正常；POF組大鼠活動量明顯減少，喜臥，行動遲緩，食欲下降，體毛失去光澤，動情周期未恢復(包括動情間期延長、動情期縮短或無動情期等)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組注射后活動量、飲食等一般情況均有所改善，且shRNA-BMSCs組改善最為明顯，3組動情周期均有所恢復，其中BMSCs組、shRNA組注射后28 d內分別有6只、5只恢復正常動情周期，shRNA-BMSCs組有11只恢復正常動情周期；shRNA-BMSCs組動情周期恢復率(73.33%)高于BMSCs組(40.00%)及shRNA組(33.33%)，差異均有統計學意義(2=3.394、4.921，均P<0.05)。

圖2 BMSCs細胞流式細胞術鑒定

圖3 BMSCs三系分化鑒定

圖4 miR-204-5p轉染效率觀察

2.4 各組激素水平比較 干預前，POF組、BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平均高于對照組，E2水平均低于對照組(P<0.05)；干預后，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；干預后，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組E2水平高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；干預后，BMSCs組與shRNA組比較，FSH、E2水平差異無統計學意義(P>0.05)。與干預前比較，干預后POF組FSH水平升高、E2水平降低，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組FSH水平降低、E2水平升高(P<0.05)；見表2。

2.5 卵巢形態學觀察及各級卵泡計數比較 HE染色顯示，BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡數量均多于POF組，但仍少于對照組(P<0.05)；shRNA-BMSCs組始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡數量均多于BMSCs組和shRNA組(P<0.05)，而shRNA組與BMSCs組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖5、表3。

表2 各組激素水平比較

圖5 卵巢形態學觀察(200×)

表3 大鼠各級卵泡計數比較

2.6 卵巢顆粒細胞凋亡情況比較 對照組、POF組、BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細胞凋亡率分別為(22.90±5.70)%、(77.46±9.31)%、(67.52±7.55)%、(66.95±7.40)%、(45.90±5.54)%，組間比較，差異有統計學意義(F=137.247，P<0.001)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細胞凋亡率均低于POF組，但仍高于對照組(P<0.05)；shRNA-BMSCs組卵巢顆粒細胞凋亡率低于BMSCs組和shRNA組(P<0.05)，而shRNA組與BMSCs組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 卵巢顆粒細胞凋亡情況(TUNEL400×)

2.7 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量比較 各組相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組miR-204-5p、MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組Bcl-2 mRNA相對表達量高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；shRNA組與BMSCs組比較，miR-204-5p mRNA相對表達量較低(P<0.05)，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 miR-204-5p、MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量比較

2.8 MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量比較 各組MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組MAPK、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組(P<0.05)；BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組Bcl-2蛋白相對表達量高于POF組，且shRNA-BMSCs組高于BMSCs組和shRNA組，但3組仍低于對照組(P<0.05)；shRNA組與BMSCs組比較，MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 Western blot蛋白免疫印記圖

3 討論

POF發病原因復雜多樣，其發病與遺傳突變、化療藥物損傷、免疫功能障礙、代謝異常等關系密切，多種因素均可能引起卵巢顆粒細胞過度凋亡，進而引起卵巢閉鎖時間縮短、性激素分泌紊亂，卵巢組織呈現圍絕經期或絕經后的衰退狀態[8-10]。卵巢早衰對育齡期女性的身心均造成嚴重影響，現有的治療方案不可逆轉卵巢顆粒細胞過度凋亡現象，臨床療效和安全性有待改進，探索安全性好、更有效的治療手段有重要臨床意義[11]。

研究顯示，BMSCs移植可提高POF卵巢儲備功能，主要依賴于干細胞分泌的旁分泌因子發揮作用[12]。miR-204-5p定位于人第9染色體，在調控脂肪組織形成、糖尿病及多種腫瘤干細胞自我更新等方面扮演重要角色[13-14]。研究表明，過表達miR-204-5p可抑制人卵巢顆粒細胞增殖能力，且抑制miR-204-5p的表達可促進人原代顆粒細胞產生雌激素[15]。Sun等[16]在研究多囊卵巢綜合癥患者卵巢顆粒細胞增殖、凋亡機制過程中發現，miR-204在卵巢顆粒細胞及卵巢皮質組織中異常低表達，證實miR-204可通過誘導卵巢顆粒細胞凋亡及細胞周期阻滯參與疾病進展。因此，miR-204-5p在育齡女性卵巢中異常表達可能通過抑制顆粒細胞增殖、促進其凋亡，導致雌激素異常分泌及卵泡生長抑制，最終導致POF的發生。

本研究發現，向POF大鼠雙側卵巢分別注射慢病毒載體、BMSCs細胞及穩定轉染慢病毒載體的BMSCs細胞后，3干預組卵巢組織中miR-204-5p mRNA表達量均降低，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，說明POF大鼠miR-204-5p基因表達被抑制。進一步觀察這3組干預后動情周期均有所恢復，血清FSH水平、卵巢顆粒細胞凋亡率均降低，其中shRNA-BMSCs組較BMSCs組及shRNA組動情周期恢復率更高，FSH水平、卵巢顆粒細胞凋亡率更低；病理染色顯示，3組干預后各級卵泡數量多于POF組，shRNA-BMSCs組增多最為明顯，說明下調miR-204-5p表達可增強BMSCs對POF大鼠卵巢結構和功能的改善作用，抑制卵巢顆粒細胞凋亡。

此外，本研究中BMSCs組、shRNA組及shRNA-BMSCs組卵巢組織中miR-204-5p mRNA及MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量均低于POF組，且shRNA-BMSCs組低于BMSCs組和shRNA組，但3組仍高于對照組，Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量與上述結果相反，提示下調miR-204-5p增強BMSCs對POF的治療作用可能與下調MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表達有關。卵巢顆粒細胞凋亡過程涉及多條信號通路，MAPK介導信號通路在多種細胞凋亡啟動過程中發揮重要作用[17-18]。Bcl-2/Bax/Caspase-3線粒體凋亡信號通路是MAPK下游重要調控通路[19-20]。石美虹等[21]研究表明，MAPK抑制劑可通過調控豬卵巢顆粒細胞周期而抑制細胞增殖活力，同時MAPK下游凋亡相關基因和蛋白Bcl-2、Bax表達水平相應改變，與本研究結果相符。Toll等[22]研究表明，沉默miR-204可通過調控MAPK信號通路參與皮膚鱗癌的進展。上述研究均說明抑制miR-204-5p表達可能通過調控MAPK及其下游線粒體凋亡信號通路，miR-204-5p被敲除、沉默或失活時，MAPK活化水平降低，Bcl-2/Bax/Caspase-3通路相關基因和蛋白表達隨之抑制，從而抑制卵巢顆粒細胞凋亡信號的啟動。由此，抑制miR-204-5p可通過下調MAPK及其下游凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表達，抑制POF卵巢顆粒細胞凋亡，而穩定轉染miR-204-5p反義寡核苷酸序列的BMSCs凋亡率更低的機制，可能與低表達miR-204-5p可提高BMSCs在體內的存活率，從而發揮協同增強作用，但具體機制仍需進一步設計實驗驗證。

4 結論

下調miR-204-5p表達具有增強BMSCs對POF大鼠卵巢結構和功能的改善作用，抑制卵巢顆粒細胞凋亡，可能與下調MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表達有關，為臨床POF的治療提供了新思路。