蓖麻種子萌發和幼苗生長對重金屬Zn2+的脅迫響應※

●尹明達 羅 蕊 包春光 孟祥越 孫 雪 王凡浩 賈崇寧 李正彩 張圓圓 黃鳳蘭,3,4,5,6,7※※

（1.內蒙古民族大學生命科學與食品學院 內蒙古 通遼 028000；2.通遼市農畜產品質量安全中心 內蒙古 通遼 028000；3.蓖麻育種國家民委重點實驗室 內蒙古 通遼 028000；4.內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心 內蒙古 通遼 028000；5.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室 內蒙古 通遼 028000；6.內蒙古自治區蓖麻產業協同創新中心 內蒙古 通遼 028000；7.蓖麻產業技術創新內蒙古自治區工程研究中心 內蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）屬雙子葉植物綱、大戟目、大戟科、蓖麻屬草本植物[1]，是重要的油料作物，在生態修復、醫藥前體開發、生物防治等領域具有很高的開發利用價值[2]。蓖麻耐旱、耐瘠薄，適應性強，不與糧棉爭地，地邊拐角均可栽植，因此我國的蓖麻資源十分豐富且分布廣泛[3]。

鋅是所有生物體必需的元素，它密切參與植物體內的各種生命代謝活動[4]。對于植物來說，鋅有利于植物生長素的形成，還有增強抗逆性的作用。植物缺鋅會導致植株短小、葉片的擴展與伸長受到限制、節間短[5]，但并不是說鋅的濃度越高植物生長就越好。對植物幼苗來說，吸取過量的鋅會明顯降低葉綠素含量，且會嚴重影響植物根和葉片的生長。現階段，鋅礦的開采、鍍鋅、儀器儀表及機械制造等工業活動，各種化工廠排放的工業廢水中都含有大量的Zn2+，燃煤的煙塵中的鋅含量也常超標，會對土壤、水源和大氣造成嚴重污染[6]。鋅污染會破壞土壤的結構與功能；還會影響土壤的理化性狀，嚴重時還會威脅土壤的自然生產力[7]。被鋅污染的土壤中微生物的種類和數量顯著降低，土壤酶的活性被破壞[8]。鋅對水的污染更加嚴重，因為鋅對水生動物的毒性更大，如用含鋅污水澆灌作物，會造成污染范圍擴大。

蓖麻對各種重金屬離子有著很高的耐受性，而鋅是蓖麻生長必不可少的微量元素，濃度過高的Zn2+又會對蓖麻產生脅迫影響。研究蓖麻對Zn2+的耐受程度及其耐受原因，對治理鋅污染土壤具有重大意義，且為后續深入開展蓖麻抗逆性研究奠定了基礎。本研究以‘2129’品系蓖麻為材料，對該種蓖麻種子及幼苗測定各項生理指標，從而研究蓖麻種子萌發和幼苗生長對Zn2+的耐受程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料‘2129’品系的蓖麻種子，由內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室提供。

1.1.2 設備與器具設備：各種型號移液器、分析電子天平EP214Dcd、高速大容量低溫離心機（multifuge X3）、小型高速低溫離心機（eppendorf Centrifuge 5424 R）、 酶 標 儀（infinite M200 pro）、HVE-50 型高溫高壓滅菌鍋、超低溫冷凍冰箱（Thermo Scientific Forma 702）。

器 具：1.5mL、4mL、15mL 離 心 管，30mL玻璃試管，50mL、100mL、500 mL、1 000mL 容量瓶，100mL、1 000mL 燒杯，玻璃棒，石英管，1 300mL 圓形塑料培養盒，直徑100mm 陶瓷研缽及缽杵。

1.1.3 試劑七水合硫酸鋅（Z nSO4·7H2O）、液氮、愈創木酚、30% H2O2、20% TCA、0.5%TBA、PBS（pH7.8，50mm）、0.1mol/L H2O2、2mm NADPH、10mm GSSG。

1.1.4 其他干凈的蛭石、干凈無污染的黃土。

1.2 試驗設計

準備飽滿健康的蓖麻種子若干，蛭石若干，黃土若干，1 300mL 圓形塑料培養盒17 個，濾紙。將圓形塑料培養盒進行121℃、20min 高壓滅菌，取出后在每個盒蓋中間部位打若干直徑為15mm 的孔洞并將濾紙粘在上面，將孔洞全部遮住。選出1 700 粒蓖麻種子，平均分成17 份。在培養盒中加入大約150g 蛭石，將17 份種子分別均勻地撒在17 個培養盒的蛭石上，再用大約150 g 蛭石將其覆蓋。用無水硫酸鋅配制不同濃度的ZnSO4溶液，分別為120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L、1 560mg/L、1 800mg/L、2 040mg/L、2 280mg/L，每種濃度的溶液800mL。向15 個培養盒中澆入不同濃度硫酸鋅溶液，并做好標記，剩余兩個培養盒中各加入800mL 清水，作為種子對照和栽種幼苗預備。將17 個培養盒放在25℃有光照的溫室中培養72 h。后用清水篩洗出來，并按不同處理分開擺放在干凈的桌面上。

在最后一個清水培養的培養盒中取根長、大小一致的40 粒蓖麻萌發種子，播種至裝有大約1.5kg/盆黃土的花盆中，使用清水與濃度120mg/L至2 280mg/L 的ZnSO4溶液分別對幼苗進行培養。

1.3 測試方法

1.3.1 種子形態學觀察對上述經過清水與濃度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培養過的蓖麻種子進行觀察，并拍照保存。

1.3.2 種子發芽率統計取上述清水與濃度120mg/L 至2 280mg/L 的ZnSO4溶液培養過的蓖麻種子，統計每份種子的萌發數量與未萌發數量，記錄數據并計算不同濃度處理后的種子發芽率。

1.3.3 種子生理指標測定膜脂受損程度以及植物的抗逆性通過檢測MDA 含量來測定[9]。蓖麻種子中MDA 含量的測定原理參照張清航[10]論文中的原理。公式：

注：V1為提取液總體積（4mL）；V2為測定用的酶液體積（1mL）；W為樣品鮮重（0.4 g）。

CAT 活性的測定。過氧化氫酶主要用于催化過 氧化氫進行反應[11-12]。對CAT 活性的測定及其原理參照Gill S S、Quan L J 與楊節[13-15]的論文。以每分鐘 OD 值變化（減小）0.1為1個酶活性單位（U）。公式：

注：ΔA240為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.2mL）。

GR 的測定。對谷胱甘肽還原酶活性的測定參照劉振玉[16]論文中所述的GR 的特性來進行測定與計算。按每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH氧化為1 個酶活單位（U）。公式：

注：ΔA340為實驗組在反應時間內吸光度的變化；ΔA空白為空白組在反應時間內吸光度的變化；ε 為NADPH 摩爾消光系數6.22×103L·mol-1·cm-1；d為比色皿內徑（5.85mm）；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（2min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V3為反應體系總體積（2.25mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.3mL）。

P OD 的測定。POD 活性的測定原理參照GARCíA-PONCE á L[17]等人的論文。以每分鐘OD值變化（升高）0.01 為1 個酶活性單位（U）。公式：

注：ΔA470為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（3min）；V1為提取酶液總體積（4 mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.02mL）。

1.3.4 幼苗形態學觀察分別取培養7d、15d、21d 的蓖麻幼苗的根與葉片，用清水洗凈并進行拍照對比觀察，清洗時注意不要損壞根莖與葉片。

1.3.5 幼苗生理指標測定葉片的生理指標測定方法參 照1.2.1 中對 種 子MDA、CAT、GR、POD 四個指標的測定，測定材料為四葉期處理后的新鮮葉片。

2 結果與分析

2.1 種子萌發對Zn2+的脅迫響應

對用清水與不同濃度ZnSO4溶液處理3d 后的種子進行觀察，蓖麻種子發芽率統計結果見表1。由表1 可以看出，用不同濃度Zn2+處理的蓖麻種子的萌發程度與清水組相比差異顯著，但未表現出明顯規律，在Zn2+濃度達到960 mg/L 時，發芽率達到最高且顯著性差異最大。

表1 蓖麻種子發芽率統計結果

對種子進行不同濃度的Zn2+處理與培養，3d后，蓖麻種子根長統計結果見表2，蓖麻種子根粗統計結果見表3。

由表2 可以看出，與清水組相比，當Zn2+濃度在480mg/L 以下時，種子根長逐漸增長；在Zn2+濃度超過480mg/L 后差異顯著，但未表現出明顯規律；在Zn2+濃度達到960mg/L 時，蓖麻種子的根長達到最高值41.32mm。由表3 可以看出，根粗則僅在部分濃度處理時差異顯著且未出現明顯規律，但在Zn2+濃度大于1 320mg/L 后，根粗數值全部低于正常數值，但沒有出現蓖麻種子死亡，證明蓖麻對鋅具有很高的耐性。此結果與呂冬梅[18]的研究Zn2+結果相吻合。

表2 蓖麻種子根長統計結果

表3 蓖麻種子根粗統計結果

分別用480mg/L、720mg/L、960g/L、1 200mg/L、1 560mg/L、2 040mg/L 的ZnSO4溶液對蓖麻種子進行培養，如圖1～7，圖中A 為處理后萌發的種子，B 為處理后未萌發的種子。

從圖1～4 可以看出，與清水組相比，Zn2+濃度達到720mg/L 時，蓖麻種子表面開始出現黃色斑塊；Z n2+濃度達到960mg/L 時斑塊明顯減少；Zn2+濃度在1 080 ～1 320 mg/L 之間時，部分種子主根明顯增長，但側生根數量減少且黃色斑塊少量增加；Zn2+濃度大于1 320mg/L 時，種子表面黃色斑塊增加，主根長度減小，幾乎無側生根。

由表1 可以看出，用不同濃度Zn2+處理的蓖麻種子與清水組相比差異顯著，但未表現出明顯規律，且在Zn2+濃度達到960 mg/L 時,顯著性差異最大。同時，在處理濃度大于960mg/L后，部分數值大大低于正常數值，因此，本實驗選用960mg/L 濃度處理的種子進行生理指標測定。

按照1.3 中所述方法對培養后的種子進行生理指標測定，種子中MDA 含量、CAT 活性、GR活性和POD 活性的測定結果，見圖8。

由圖8 可以看出，與清水培養后的種子相比，不同Zn2+濃度處理的種子MDA 含量、CAT和POD 活性都低于對照，GR 活性則遠遠高于對照。

2.2 幼苗生長對Zn2+的脅迫響應

根據各處理下蓖麻種子萌發情況，選用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液對蓖麻幼苗進行培養，分別在7d、15d、21d 時對幼苗的整體、葉片及根部進行觀察并分析。結果見圖9、圖10、圖11。圖A 為處理后的幼苗植株形態，圖B 為處理后的幼苗葉片形態，圖C 為處理后的幼苗根形態；CT 為實驗組，CK 為對照。

可以發現，幼苗植株在培養7d 時與對照相差不大，隨著時間增加，植株越來越小；幼苗根長在培養7d 時比對照長約1/3，到15d 時根長嚴重縮短，到21d 時，側生根明顯減少且主根呈現不健康的棕紅色；幼苗葉片在培養7d 時與對照無明顯差異，到15d 時葉片開始褪綠并出現黃色斑點，到21d 時，葉片嚴重褪綠，葉面大幅度縮小且黃色斑塊增多。但即使在該濃度下處理21d，幼苗仍未出現死亡，證明蓖麻對Zn2+具有很強的耐性。

根據1.3中所述方法對培養7d、15d、21d 后的幼苗分別進行生理指標測定，幼苗MDA 含量、CAT活性、GR 活性、POD 活性的測定結果，見圖12。

由圖12 可以看出，用Zn2+濃度為960mg/L的ZnSO4溶液處理的幼苗MDA 的含量與POD 活性低于對照很多，而CAT 與GR 活性則高出對照很多，其中用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液處理的幼苗的POD 活性與對照相差最多。且在整個實驗過程中，沒有出現幼苗死亡現象，證明蓖麻對Zn2+的耐受程度極高。

3 討論

隨著鋅污染日益增加，大量含鋅污染物以塵、煙等形式排放到環境中，并最終通過土壤、水源、植物吸收和積累對人類健康造成威脅[19]。高效的處理鋅污染逐漸成為目前急需解決的問題。植物對重金屬的耐受程度與重金屬在其體內的積累、轉運等因素密切相關[20]。重金屬脅迫不但會影響植物中葉綠素的合成，還會影響植物體內的正常代謝，最終導致植物體中各物質含量的改變[18]。相關分析表明，Zn2+在植物體內積累超出閾值，會對植物造成毒害，抑制植物生長發育，嚴重可能造成植物死亡[21]。蓖麻根系發達，抗逆性較強，對Zn2+有很大的耐受性，可以通過吸收和代謝實現對土壤中鋅的吸附、凈化、固定[22]。Rosselli[23]等的研究表明，植物中Zn2+的轉運能力較好，大部分向地上部分運輸。抑制生長和減少植株生物量是植物對Zn2+脅迫的普遍響應[24，25]。本實驗表明，蓖麻吸收小于960mg/L 濃度的Zn2+會促進其生長，而吸收超過960mg/L 濃度的Zn2+則會對蓖麻產生毒害，抑制其生長，這與Rosselli的研究結果一致。與蓖麻相比，臭椿僅能適應在Zn2+濃度不超1 000mg/L 的土壤中生存，法桐對Zn2+的耐受性更弱，不適合種在鋅污染土壤中[26]。而本實驗中所用最高濃度Zn2+（2 280mg/L）處理的蓖麻仍未出現死亡現象，證明相比于其他植物，蓖麻對Zn2+耐受性更強。

4 結論

在種子萌發階段，隨著Zn2+濃度升高，蓖麻種子的發芽率雖然差異顯著，但無明顯趨勢，在Zn2+濃度達到960mg/L 時達到最大發芽率且顯著性差異最大；根長與根粗顯示出先增后降，再增再降的趨勢；在生長過程中即使Zn2+濃度達到2 280mg/L，種子仍未出現死亡現象，證明蓖麻對鋅有很高的耐受程度；在Zn2+濃度達到960mg/L 時，蓖麻種子中吸收了過量鋅，影響了其生長。在幼苗生長階段，用Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液處理幼苗，隨著處理時間的增加，幼苗植株越來越矮小，根長縮短，葉片越來越小且褪綠越來越嚴重；生理指標與對照相比證明在Zn2+濃度為960mg/L 的ZnSO4溶液培養下，蓖麻幼苗吸收的Zn2+逐漸增多，最終超過閾值，對蓖麻苗產生了嚴重傷害，影響其生長。但在整個實驗過程中，處理后的種子和幼苗均未出現死亡現象，證明蓖麻對Zn2+有極高的耐受性。