間充質干細胞移植治療系統性紅斑狼瘡骨質疏松效果分析

劉瑞霞，許文英（通訊作者）

（蘇州市立醫院本部 江蘇 蘇州 215000）

系統性紅斑狼瘡（SLE）是可累積全身各系統的自身免疫病，累及骨骼肌肉系統可導致骨量流失出現骨質疏松。由研究證實初發SLE 患者也可存在骨質疏松[1]，現階段研究證實SLE 患者體內的炎癥因子在其骨質疏松的發生發展中尤為重要[2]。有研究發現，SLE 患者體內TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子水平異常[3-4]。近年來，越來越多的研究證實T 細胞產生的IL-17 在多種自身免疫性疾病中起重要作用[5-7]。在SLE 患者TNF-α可促進破骨前體細胞的增值，活化NF-KB 受體活化因子（RANK）促進破骨細胞生成，促進破骨細胞分泌RANK和成骨細胞分泌RANKL，二者結合可激活進一步NF-KB及其下游相關蛋白，這些蛋白分子促進破骨細胞的活化及分化成熟，從增加骨吸收[8-10]。目前研究已發現多條信號通路參與MSCs 成骨分化，如Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Notch、Hedgehog、FGF，且相互調節，其中BMP/Smad 信號通路最早發現且最為重要[11]。間充質干細胞有多向分化潛能，具有免疫調控作用，通過臨床行USMSCs 輸注后評估骨代謝相關信號通路表達水平的變化。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月—2016 年1 月住院SLE 并發骨質疏松患者8 例，均符合美國風濕病學會（ACR）1997 年SLE 分類標準，其中女性7 例，男性1 例，年齡30 ～50歲。入組患者分別與移植前、移植后1 月、3 月、6 月隨訪，使用PCR 方法檢測患者外周血單個核細胞骨代謝基因表達水平。

1.2 方法

（1）分離外周血單個核細胞（PBMC），提取測定RNA。

（2）設計及合成引物：應用Primer Primier 5.0軟件設計內參基因GAPDH 及目的基因的引物序列，上海生工生物工程技術公司合成。

（3）反轉錄及熒光定量：PCR 對RNA 進行反轉錄，同時對產物進行普通PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗引物特異性并選取最佳退火溫度。對各組標本的基因行熒光定量PCR。

1.3 統計學分析

應用SPSS 16.0 軟件行統計學分析，以均數±標準差（±s）表示計量資料，各組數據符合正態性分布與方差齊性，采用單向方差分析進行多組之間的均數比較。P＜0.05 認為具有統計學差異。

2.結果

（1）對 比 移 植 后1 月、3 月SLE 患 者PBMC 的TNF-α、NF-κBp50 和NF-κBp65 mRNA 水平下降（P＜0.05），移植后6 月NF-κBp65 mRNA 水平仍較處于低水平，逐漸接近移植前水平且有統計學差異（P＜0.05）。詳見表1。

表1 移植前后TNF/NFκB 信號通路mRNA 表達水平（± s）

表1 移植前后TNF/NFκB 信號通路mRNA 表達水平（± s）

TNFα NFκBp50 NFκBp65移植前 0.41±0.35 0.58±0.32 0.56±0.31移植后1 月 0.31±0.10 0.28±0.14 0.16±0.09移植后3 月 0.28±0.11 0.31±0.12 0.11±0.03移植后6 月 0.37±0.05 0.48±0.08 0.28±0.06 F 4.43 4.81 5.70 P 0.04 0.03 0.00

（2）移植前后BMP2、Smad1、Smad5 和Smad8 的mRNA 水平無統計學差異（P＜0.05），移植后6 個月逐漸接近移植前水平。詳見表2。

表2 移植前后BMP/Smad 信號通路mRNA 表達水平（± s）

表2 移植前后BMP/Smad 信號通路mRNA 表達水平（± s）

BMP2 Smad1 Smad5 Smad8移植前 0.50±0.29 0.73±0.21 0.58±0.26 0.51±0.24移植后1 月 0.78±0.83 0.98±0.25 0.73±0.15 0.71±0.12移植后3 月 0.80±0.28 0.82±0.21 0.69±0.21 0.63±0.21移植后6 月 0.51±0.27 0.77±0.15 0.48±0.18 0.47±0.19 F 0.53 1.36 1.31 0.77 P 0.66 0.29 0.31 0.54

3.討論

系統性紅斑狼瘡是以T、B 淋巴細胞等免疫功能異常為主要發病機制[12-13]，近年來隨著SLE 生存率的增加，繼發骨質疏松已成為影響患者生活質量的嚴重并發癥[14-15]。

目前的研究認為TNF-α 水平異常誘導破骨細胞的分化和成熟是導致SLE 患者發生炎癥介導骨質疏松的重要因素。本研究擬通過檢測移植前后TNF-α/NF-κB 信號通路基因表達水平的變化評估臍帶間充干細胞移植治療SLE 骨質疏松有效性。在骨代謝中，偶聯骨形成和骨吸收兩個過程的重要信號通路是OPG/RANK/RANKL[17]，RANK/RANKL 在破骨細胞的生成調節中起重要作用，二者結合后入核啟動NF-κB 的活化，進一步與NFAT-c1 結合啟動破骨基因活化，誘導破骨細胞分化成熟[18]，而OPG與RANKL 競爭性結合科阻斷上述過程，抑制下游信號轉導，從而抑制破骨細胞分化成熟。

已有研究證實狼瘡患者MSCs 成骨分化能力較正常人減弱[16]，近年來行MSCs 移植治療難治性SLE 已有研究，本次試驗我們經外周靜脈移植，意在探討MSCs治療SLE 骨質疏松的可能機制。結果發現，在靜脈輸注MSCs 后的狼瘡患者體內BMP/Smad 中基因表達水平變化雖無統計學差異，但整體水平有升高，且TNF-α/NF-κB 通路中各基因表達下降；據此有理由推測，UCMSCs 移植可能通過調節BMP/Smad 及TNF/NF-κB 信號通路治療骨質疏松。

綜上，本實驗通過體內實驗證實了UCMSCs 移植對骨代謝信號通路調節，一定程度上說明MSCs 移植治療骨質疏松可能是通過抑制TNF-α，作用于MSCs BMP/Smad 信號通路。