替米考星琥鉑酸鈉的制備和評(píng)價(jià)

張寶華，郭瑞霞，史蘭香

（石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

0 引言

替米考星是一種半合成大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗菌素，具有很強(qiáng)的抗菌活性，抗菌譜廣，與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性，主要通過(guò)抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而起到殺菌作用，無(wú)論口服還是注射，在畜禽體內(nèi)吸收都很快，半衰期較長(zhǎng)，藥物組織穿透力強(qiáng)，表觀分布容積大，肺組織中藥物濃度高，廣泛應(yīng)用于牛、山羊、豬、雞等動(dòng)物的感染性疾病.

由于替米考星水溶解性差、分散性低，群體直接混飼或飲水給藥存在困難. 針對(duì)替米考星在水中溶解度差的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，如制備成替米考星預(yù)混劑[1]、微乳[2]、注射液[3]、β-環(huán)糊精包合物[4]等，但這些制劑在水中溶解度不高，存在穩(wěn)定性較差、乳化劑和助乳化劑的用量過(guò)高、用到有毒有刺激性的有機(jī)溶劑等缺點(diǎn). 原研商Elanco 公司推出了水溶性好的磷酸替米考星，臨床應(yīng)用廣泛，但磷酸替米考星的動(dòng)物適口性差[5]. 李逐波等制備了丁二酸替米考星復(fù)合物[6]、富馬酸替米考星復(fù)合物[7]和蘋果酸替米考星復(fù)合物[8].這些復(fù)合物在水溶性方面有所改善，但仍不太理想. 梁桂霞等[9]制備了替米考星糖精復(fù)合物，相較替米考星，溶解度提高了9 倍. 秦光成[10]將難溶于水的抗菌藥氟苯尼考制備成了氟苯尼考琥鉑酸酯鈉前藥，極易溶于水，抗菌活性與氟苯尼考相當(dāng)，擴(kuò)大了臨床應(yīng)用范圍，值得借鑒. 筆者以4-二甲氨基吡啶（DMAP）為催化劑，通過(guò)替米考星與琥鉑酸酐反應(yīng)制備了替米考星琥鉑酸酯，再經(jīng)與碳酸氫鈉成鹽，制備了替米考星琥鉑酸酯鈉. 替米考星琥鉑酸酯鈉穩(wěn)定性好，易溶于水，抗菌活性與替米考星相當(dāng).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

13C-NMR 用Brucker Avance DMX400（400 MHz，125 MHz，Bruker 公司，德國(guó)）測(cè)定；MS 用Waters ZQ2000液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Waters 公司，美國(guó)）測(cè)定；試劑均為分析純.

1.2 合成方法

1.2.1 替米考星琥鉑酸酯的合成

將86.9 g 替米考星溶于500 mL 無(wú)水丙酮中，加入2.6 g DMAP，加熱回流，慢慢加入24 g 琥鉑酸酐，反應(yīng)4 h. 薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完畢，減壓蒸出丙酮，殘留物中加入300 mL 二氯甲烷溶解，依次用飽和食鹽水（10 mL×3）、水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，濃縮至一定體積，放置過(guò)夜，再過(guò)濾，濾餅用75%的乙醇溶液重結(jié)晶2 次，制得替米考星琥鉑酸酯96.5 g，收率90.3%，含量≥95% [HPLC 測(cè)定條件：Waters sysmmtry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈∶四氫呋喃∶磷酸二丁胺緩沖液∶水=110∶55∶25∶800（體積比），tR=12.1 min]. MS（m/z）：Calcd. for C54H88N2O19：1 068.60[M]+；Found：1 068.63；13C NMR（125 MHz，CDCl3），δ：9.2（CH3），9.5（CH3），12.9（CH3），17.7（2CH3），17.9（CH3），19.5（CH3），19.7（CH3），24.1（CH2），25.4（CH2），29.8（CH），30.0（CH），30.7（2CH2），31.5（CH），34.0（CH2），34.4（2CH2），39.4（CH2），41.7（2CH3），42.3（CH），42.4（CH2），45.1（2CH），54.3（CH2），65.6（CH2），58.8（CH2），59.7（CH），61.7（CH3），63.5（CH2），66.3（CH），69.3（CH2），69.3（CH），70.1（CH），70.6（CH），70.9（CH），72.7（CH），73.2（CH），73.8（CH），79.2（CH），79.9（CH2），82.1（CH），101.1（CH），104.3（CH），118.5（CH），134.9（C），143.5（CH），147.8（CH），172.8（C），172.1（C），173.7（2C），178.0（2C），201.8（C）. 合成路線見(jiàn)圖1.

1.2.2 替米考星琥鉑酸酯鈉的合成

將53.4 g 替米考星琥鉑酸酯加入到250 mL 無(wú)水乙醇中，加熱至45～47 ℃溶解.再將8.4 g NaHCO3加入到50 mL 乙醇-水溶液（體積比1∶1）中加熱溶解，然后將NaHCO3的乙醇-水溶液慢慢加入到替米考星琥鉑酸酯的無(wú)水乙醇溶液中，45～47 ℃條件下反應(yīng)1 h，過(guò)濾，除去不溶物，減壓蒸除乙醇，噴霧干燥，制得替米考星琥鉑酸酯鈉，收率100%.

1.3 HPLC 檢測(cè)

依據(jù)《藥典》提供的HPLC 法進(jìn)行測(cè)定.

圖1 替米考星琥鉑酸酯鈉的合成

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳工藝條件的確定

2.1.1 催化劑的篩選

以替米考星與琥鉑酸酐的投料摩爾比為1∶2.4，丙酮為溶劑，加熱回流條件下，分別加入替米考星用量的3%的DMAP、吡啶和三乙胺，對(duì)催化劑進(jìn)行篩選（表1）. 從表1 可以看出，吡啶和三乙胺催化活性中等，DMAP 催化活性最好，替米考星琥鉑酸酯的收率達(dá)到90.3%.

表1 催化劑的篩選

2.1.2 催化劑用量的考察

分別選替米考星用量的1%，2%，3%，4%的催化劑DMAP，按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，考察催化劑用量對(duì)產(chǎn)物收率的影響（表2）. 從表2 可以看出，隨著催化劑用量的增加，產(chǎn)物收率提高，但催化劑用量達(dá)到3%時(shí)，產(chǎn)物收率最高，再增加催化劑用量時(shí)，產(chǎn)物收率提高不明顯，故催化劑用量?jī)?yōu)選為3%.

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間和溶劑的影響

分別選無(wú)水丙酮、無(wú)水乙腈和無(wú)水乙醇為溶劑，按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，考察溶劑和反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物收率的影響（表3）. 從表3 可以看出，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，與無(wú)水乙醇和無(wú)水乙腈為溶劑相比，無(wú)水丙酮為溶劑產(chǎn)物收率高. 隨著反應(yīng)溫度的提高，反應(yīng)時(shí)間縮短，產(chǎn)物收率降低，說(shuō)明較高反應(yīng)溫度下有副反應(yīng)發(fā)生. 故優(yōu)選無(wú)水丙酮為溶劑，反應(yīng)溫度為56～57 ℃.無(wú)水丙酮為溶劑，反應(yīng)溫度為56～57 ℃的條件下，將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至5 h，產(chǎn)物收率沒(méi)有提高，將反應(yīng)時(shí)間縮短至3 h，反應(yīng)不完全，產(chǎn)物收率降低，故優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為4 h.

2.1.4 原料配比的影響

按上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，考察原料摩爾配比對(duì)產(chǎn)物收率的影響（表4）. 從表4 可以看出，隨著琥鉑酸酐量的增大，產(chǎn)物收率增高，但當(dāng)n（替米考星）∶n（琥鉑酸酐）=1∶2.4 時(shí)，產(chǎn)物收率達(dá)到最高，再繼續(xù)增加琥鉑酸酐的用量，產(chǎn)物收率變化不明顯，所以替米考星與琥鉑酸酐的摩爾比優(yōu)選為1∶2.4.

表2 催化劑用量的篩選

表3 反應(yīng)時(shí)間和溶劑的篩選

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在以丙酮為溶劑，反應(yīng)溫度為56～57 ℃，反應(yīng)時(shí)間為4 h，DMAP 用量為替米考星用量的3%，n（替米考星）∶n（琥鉑酸酐）=1∶2.4，n（替米考星琥鉑酸酯）∶n（碳酸氫鈉）=1∶2 的最佳工藝條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，產(chǎn)物平均收率為90.3%.

表4 原料配比的影響

2.3 穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度的影響

取適量替米考星琥鉑酸酯鈉均勻平攤于表面皿內(nèi)，厚度小于5 mm，置恒溫干燥箱內(nèi)，40 ℃恒溫下放置10 天，分別在0，5，10 天取樣，對(duì)替米考星琥鉑酸酯鈉的性狀、含量進(jìn)行觀察測(cè)定（表5）. 從表5 可以看出，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，替米考星琥鉑酸酯鈉外觀沒(méi)有發(fā)生改變，但含量有所下降，說(shuō)明它與替米考星一樣，對(duì)溫度敏感，高溫會(huì)使其含量下降，需要低溫陰涼處保存.

2.3.2 強(qiáng)光照射的影響

取適量替米考星琥鉑酸酯鈉均勻平攤于表面皿內(nèi)，厚度小于5 mm，置綜合藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱內(nèi)，在照度4 500±500 Lx，溫度25 ℃條件下放置10 天，分別在0，5，10 天取樣，對(duì)替米考星琥鉑酸酯鈉的性狀、含量進(jìn)行觀察測(cè)定（表6）. 從表6 可以看出，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，替米考星琥鉑酸酯鈉外觀由白色粉末變成淺黃色粉末，含量也有所下降，說(shuō)明產(chǎn)物對(duì)強(qiáng)光照射敏感，光照會(huì)使其含量下降，需要避光保存.

2.3.3 高濕度的影響

取適量替米考星琥鉑酸酯鈉均勻平攤于表面皿內(nèi)，厚度小于5 mm，置綜合藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)箱內(nèi)，在相對(duì)濕度90%，溫度25 ℃條件下避光放置10 天，分別在0，5，10 天取樣，對(duì)替米考星琥鉑酸酯鈉的性狀、含量進(jìn)行觀察測(cè)定（表7）. 從表7 可以看出，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，替米考星琥鉑酸酯鈉出現(xiàn)少量結(jié)塊，含量基本沒(méi)有變化，說(shuō)明產(chǎn)物的水溶性導(dǎo)致吸潮結(jié)塊，高濕對(duì)其含量無(wú)影響.

表5 高溫對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響（n=3）

表6 光照對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響（n=3）

2.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

依文獻(xiàn)[11]的方法，對(duì)替米考星琥鉑酸酯鈉體外抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)（表8）. 從表8 可以看出，替米考星琥鉑酸酯鈉對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和豬肺炎支原體的最小抑菌濃度（MIC）分別為160，2.5，2.5，320，0.312 5 μg/mL，其抗菌活性與替米考星相當(dāng). 但替米考星琥鉑酸酯鈉克服了替米考星不溶于水的缺點(diǎn)，應(yīng)用方便，適合群體直接混飼或飲水給藥，擴(kuò)大了臨床應(yīng)用范圍.

表7 高濕度對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響（n=3）

表8 替米考星琥鉑酸酯鈉體外抗菌活性

3 結(jié)論

替米考星與琥鉑酸酐在催化劑DMAP 的作用下，經(jīng)酯化、成鹽反應(yīng)，制備了替米考星琥鉑酸酯鈉. 在最佳工藝條件下，產(chǎn)物收率達(dá)90.3%. 替米考星琥鉑酸酯鈉鹽的穩(wěn)定性和溶解性好，抗菌活性與替米考星相當(dāng).