基于公共數據庫分析MFAP2在食管癌中表達及其預后意義

孫文 舒揚

1常州市第四人民醫院檢驗科，江蘇213000；2江蘇大學附屬醫院中心實驗室，鎮江212000

食管癌是世界上第八大癌癥，同時病死率在癌癥相關死亡中排名第六［1］。食管癌有80%的病例發生在欠發達的發展中國家，其中亞洲和非洲發病率最高［2］。食管癌通常被診斷出來就已是晚期階段，主要原因是癌癥早期缺乏典型的臨床癥狀以及與其他相關疾病癥狀相似而被漏診。患有晚期疾病患者最常見的癥狀是會出現進行性吞咽困難或無意識的體質量減輕［3］。全球食管癌患者5年總體生存率為15%～20%［4］，所以提高疾病的早期診斷率有助于降低病死率。本文的研究目的就是要尋找到一個新的食管癌預后生物標志物。

微纖維相關糖蛋白2（MFAP2）存在于許多組織的細胞外基質中，是彈性蛋白相關微纖維的主要抗原，可與原纖維蛋白相互作用以調節微纖維的功能，也是遺傳性結締組織病的病因。目前的科學研究表明，MFAP2在很多腫瘤中的表達增高，例如胃癌［5］、黑色素瘤［6］、頭頸部鱗狀細胞癌，但MFAP2在食管癌中表達及預后文獻報道少見。本研究首先檢索Oncomine及GEPIA數據庫中有關MFAP2在食管癌中的表達信息，然后利用在線網站UALCAN從多個角度分析MFAP2在不同臨床信息的食管癌患者組織樣本中的mRNA表達，并通過Kaplan-Meier Plotter在線分析MFAP2在食管癌中的表達與臨床預后的相關性；最后通過STRING構建目的基因蛋白互作網絡，以期了解MFAP2在食管癌中的功能作用，為尋找新的食管癌早期診斷指標、預后標記物及潛在的治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 MFAP2在Oncomine數據庫中的表達Oncomine數據庫（https：//www.oncomine.org/）是一個全世界知名的腫瘤基因數據庫，可以直接生成可視化圖片結果，其高效能的分析能力和大量儲存樣本保證分析結果具有較大的參考價值。首先登錄Oncomine數據庫，然后進行檢索條件的設置：（1）Input：Esophageal cancer；（2）Gene：MFAP2；（3）Select the analysis type：cancer vs.normal。通過上述搜索可以獲得有關MFAP2的數據集，然后進行具體分析。

1.2 MFAP2在GEPIA數據庫中的表達GEPIA數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是基于癌癥和正常基因表達譜分析的一個公共數據庫。其數據來源于TCGA以及GTEx項目的腫瘤和正常樣本的RNA測序數據，可以進行非常全面地表達分析。首先打開GEPIA在線軟件，在differential genes下的Dateset選擇ESCA，其余默認|log2FC|Cutoff：1，q-value cutoff：0.01，選用ANOVA方法，最后點擊List，即可得出ESCA的差異表達基因。

1.3 MFAP2基因在人食管癌和正常組織中的表達分析UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個可以公開訪問的癌癥數據在線分析網站，可以用來驗證新的生物標志物，提供基因表達水平、生存分析、相關性分析。利用UALCAN在線分析軟件分析MFAP2基因在食管癌及正常癌組織中的表達。在軟件主頁輸入MFAP2基因，選擇食管癌組織，獲得MFAP2在正常組織和食管癌組織中的差異表達，本研究將從原發食管癌原發組織、不同種族、不同性別、不同年齡階段、不同分期、不同分級、不同的抽煙狀態、TP53是否突變與正常鄰近組織的表達情況等多個角度分析MFAP2的表達差異。

1.4 生 存 分 析Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com/）是一個新的生物預后指標分析工具，數據來源于GEO、EGA和TCGA數據庫，為了分析特定基因在腫瘤的預后價值，根據擬議生物標志物的各種分位數表達，將患者樣品分為兩組。通過Kaplan-Meier生存圖比較這兩個患者隊列，并計算95%置信區間和logrankP值的危險比。首先登錄Kaplan-Meier Plotter在線數據庫，輸入MFAP2基因，分別選擇在食管腺癌和食管鱗癌中進行總生存分析。

1.5 構建PPI網絡STRING（http：//string-db.org/）是一個搜尋已知和預測蛋白質之間相互作用的數據庫，可以用于分析基因組學的數據、蛋白質結構的注釋，探索預測目的基因蛋白的相互作用。數據來源于收集和重新評估有關于目前現有的實驗數據，已知數據庫中的蛋白質復合物［7］，然后再Search框中輸入MFAP2基因，物種選擇“Homo sapiens”進行搜索，在“settings”中選擇minimum required interaction score為0.04，最后在“Exports”中下載。

2 結 果

2.1 MFAP2在各種腫瘤中的表達在Oncomine數據庫中收集到了430項有關MFAP2基因表達在正常組與腫瘤組的研究數據集，其中MFAP2表達差異有統計學意義的數據集一共有107項，有104項MFAP2表達增高，3項表達降低。而在食管癌的研究中只有4項表達增高，未有表達降低的研究數據集（圖1）。

2.2 MFAP2在食管癌中的表達在Oncomine數據庫中共找到4項MFAP2在食管癌中表達增高的數據集。這些數據集發表的雜志分別是Clinical Cancer Research、BMC Genomics、Cancer Research和PLoS One。筆者通過對找到的4項有關MFAP2在食管癌中表達增高的數據集中進一步分析，發現與正常組相比，MFAP2在食管癌中顯著高表達（P＜0.05）（表1）。為了驗證以上分析結果，筆者進一步挖掘分析GEPIA數據庫，在differential genes中找到食管癌數據集中的差異基因，其中包含了MFAP2基因（log2FC=2.897，校正P=8.86E-57），發現MFAP2基因在食管癌中的表達上調。

圖1 Oncomine數據庫中MFAP2基因在腫瘤中的整體表達情況

2.3 MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織及正常組織中的表達利用UALCAN數據庫分析MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織與正常組織中的表達差異。通過上述UALCAN數據庫的分析，筆者發現和正常組織相比，MFAP2基因在21～60歲人群、1級食管癌患者、吸煙的食管癌患者中顯著上調（圖2）。

2.4 MFAP2在食管癌中的生存預后分析為了探索MFAP2與食管癌之間的生存預后關系，利用Kaplan-Meier Plotter在線網站，分別獲得MFAP2在食管腺癌及食管癌的臨床樣本，并進行總生存分析。根據目的基因的表達差異將其分為高表達組與低表達組，結果發現MFAP2基因在高表達組的食管腺癌患者生存率較低（P=0.035），而MFAP2的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者生存預后之間不存在相關（P=0.066）（圖3）。

通過在線數據庫Kaplan-Meier Plotter進一步探索MFAP2在不同食管腺癌中的生存預后關系，對不同臨床樣本信息的食管腺癌患者進行生存預后分析：在男性，調節性T細胞富集、富含2型輔助性T細胞的食管腺癌患者中生存率較低，預后相對較差。而在巨噬細胞富集的食管癌患者中生存率較高，預后較好（圖4）。

2.5 PPI網絡構建通過STRING數據庫構建MFAP2基因的PPI網絡用于探索MFAP2基因的功能，共發現10個與之相關的功能蛋白（圖5）。其中纖維蛋白1（FBLN1）引起了注意，FBLN1是一種分泌的糖蛋白，已整合到纖維狀細胞外基質中，需要鈣結合來介導其與層粘連蛋白和硝態素的結合。FBLN1通過結合纖維蛋白原介導血小板粘附。FBLN1在結腸癌［12］、肝癌［13］中已有相關報道。這個蛋白基因也被證實與食管腺癌的發生發展和預后有關［14］。為了進一步確定它們之間的關系，筆者通過在線軟件GEPIA進行Spearman相關分析，結果發現MFAP2與FBLN1的表達為正相關（圖6）。

3 討 論

食管癌是一個極具侵略性和較差存活率的異質性疾病，由于其遺傳學病史及較低的早期診斷率，是全世界面臨的健康問題之一，也是中國最常見的惡性腫瘤之一［15］，在我國各種惡性腫瘤中病死率占居第4位。在中國有一個明顯的特征，就是城市與農村的食管癌患者分布不一致，農村地區的食管癌患者的發病率遠高于城市地區的患者［16］。食管癌發生的主要危險因素有吸煙、飲酒、肥胖、胃食管反流、飲食習慣等。其中食管腺癌發生的主要危險因素是肥胖、胃食管反流，反流癥狀越頻繁、越嚴重、持續時間越長，風險就越大。吸煙和飲酒是食管鱗狀細胞癌患者的兩大危險因素，常見于發達國家［17］。越來越多的研究證據表明，對食管癌分子組成的全面理解不僅需要關注腫瘤細胞，而且還需要關注腫瘤微環境，其中包含多種細胞群、信號傳導因子以及與腫瘤細胞相互作用并支持腫瘤各個階段的結構分子［18］，了解食管癌的發生發展對于其診斷和治療非常重要。筆者運用生物信息學的方法對以上數據庫進行分析挖掘，發現MFAP2在食管癌中表達上調以及MFAP2高表達的食管腺癌患者的生存率低。

近年來，有關MFAP2基因在腫瘤中過表達的報道越來越多，而未見其在食管癌中的研究報道。本研究利用公共數據庫Oncomine在線分析發現MFAP2基因在食管癌中的表達增高。通過GEPIA數據庫在線對目的基因MFAP2進行差異分析，進一步驗證了這一結論。為了進一步了解MFAP2在不同臨床病理信息的食管癌患者中的表達情況，筆者利用UALCAN數據庫在線分析，結果發現和正常的食管組織相比，MFAP2在21～60歲的人群，分級為1級的患者中，抽煙的食管癌患者中MFAP2基因上調更顯著。利用Kaplan-Meier Plotter數據庫進行在線分析，把MFAP2基因按表達水平分為兩組，分別為表達上調組和表達下調組，在表達上調組的食管腺癌患者總體生存率較差；然而MFAP2的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者生存預后之間不存在相關。筆者通過在線數據庫Kaplan-Meier Plotter又進一步探索MFAP2在不同臨床信息及不同免疫細胞浸潤的食管腺癌患者中的預后分析，結果顯示：在男性、調節性T細胞富集、富含2型輔助性T細胞的食管腺癌患者中生存率較低，預后相對較差。而在巨噬細胞富集的食管癌患者中生存率較高，預后較好。通過STRING數據庫在線構建MFAP2基因的蛋白互作網絡，為研究目的基因的功能提供線索，結果發現共有10個預測的功能蛋白與MFAP2相互作用，其中FBLN1蛋白基因被證實與食管腺癌的發生發展有關，食管腺癌中FBLN1發生了復雜的染色體重排并產生了新型融合轉錄本。利用GEPIA數據庫對MFAP2與FBLN1基因進行Spearman相關分析，發現MFAP2與FBLN1的表達為正相關的關系，說明MFAP2基因可能影響食管腺癌患者的預后，也有可能會引起染色體的重排。通過對MFAP2基因在食管癌中表達及預后進行全面分析，發現MFAP2具有重要的研究意義，MFAP2基因作為一種細胞外基質蛋白［19］，可能與調節性T細胞、2型輔助性T細胞等免疫細胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環境［18］，同時也可能成為食管腺癌的一個新的生物學指標以及潛在的治療靶點。

表1 MFAP2在食管癌研究中的過度表達情況

圖2 MFAP2在不同臨床信息的食管癌組織中的差異表達（A為正常食管組織比原發食管癌，B為正常食管組織比不同年齡段的食管癌，C為正常食管組織比不同分級的食管癌，D為正常食管組織比不同抽煙狀態的食管癌）

圖3 MFAP2在食管腺癌與食管鱗狀細胞癌中的預后生存曲線（A為MFAP2在食管腺癌中的預后生存曲線，B為MFAP2在食管鱗狀細胞癌中的預后生存曲線）

圖4 MFAP2在不同食管腺癌中的生存預后關系（A為男性食管腺癌患者的MFAP2表達，B為巨噬細胞富集患者的MFAP2表達，C為調節性T細胞富集患者的MFAP2表達，D為富含2型輔助性T細胞患者的MFAP2表達）

圖5 構建MFAP2基因相關的蛋白互作網絡

圖6 MFAP2基因與FBLN1的表達呈正相關

總之，本研究通過綜合公共數據庫的數據信息進行深入挖掘，提出MFAP2可能是食管癌中的潛在的促癌基因，且生存分析發現MFAP2與食管腺癌患者預后有關，與食管鱗狀細胞癌患者的預后不相關，同時MFAP2可能與免疫細胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環境。構建MFAP2蛋白互作網絡，結果提示MFAP2極有可能與染色體的異常有關。生物信息學的快速發展加快了科學研究者們研究的步伐［20］，但由于其缺乏實驗數據的佐證，不能更深入驗證MFAP2在食管腺癌中作用機制。所以MFAP2在食管腺癌中的發生發展機制及其具體功能還有待進一步研究。