孔雀石綠膠體金檢測樣品前處理工藝的優化

高海崗， 劉秀梵*， 王曉泉， 蔣春茂， 鄭硯超

（1.揚州大學，江蘇揚州225009；2.江蘇農業職業技術學院，江蘇泰州225300；3.無錫中德伯爾生物技術有限公司，江蘇無錫214174）

孔雀石綠又叫孔雀綠、堿性綠，是一種人工合成的三苯甲烷類燃料（陳義元，2018），因其在細菌合成過程中能阻止蛋白肽的形成而具有殺菌效果，被廣泛用于水產養殖和運輸領域。但孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠（LMG）具有致癌、致畸和致突變毒性， 已被多國禁用，2002 年農業部頒布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中明確禁止使用孔雀石綠等多種違禁藥物。 但多年來的檢測結果顯示， 我國部分省市在養殖領域和流通領域還在長期使用（師真等，2020；林锏銳等，2019；范芳芳等，2019），嚴重危害農產品食用安全。

根據文獻報道和相關檢測數據顯示，國內市面上出售的水產品中孔雀石綠、 硝基呋喃類藥物、 氯霉素的檢出率為6.5% ～ 23.2%（李菊等，2020）。 為快速監測養殖領域和流通領域違法使用獸藥，我國出現了大量的快速檢測試劑盒和檢測試紙條。 目前前處理方法一般為使用乙腈、二氯甲烷提取，硼氫化鉀等進行還原，使孔雀石綠還原成隱性孔雀石綠檢測（劉柳等，2020；王雪峰等，2018）；或者直接用乙腈提取，中性氧化鋁凈化，直接上機檢測（朱飛如和馮俊富，2018）。但由于前處理方法過于復雜，仍然不能保證在有限的時間內，快速、準確的檢測違禁藥物。本實驗采用提取、氧化、濃縮和復溶四個步驟，對氮吹、SPE柱、 反萃取三種不同提取方式進行前處理比較，通過膠體金免疫層析試紙條進行檢測，旨在對建立基層快速檢測方法提供指導性建議。

1 材料與方法

1.1 試劑 孔雀石綠快速檢測試紙條、SPE-HLB柱，由無錫中德伯爾生物技術有限公司提供；氯化鈉、鹽酸羥胺、乙酸鈉、甲醇、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、乙酸乙酯、四氯苯醌、乙腈、吐溫-20 均為分析純，購自國藥集團；隱性孔雀石綠、孔雀石綠標準品，購自德國DR.E。

1.2 儀器 振蕩器，購自其林貝爾儀器制造有限公司；離心機，購自萬合儀器制造有限公司；氮吹儀，購自無錫中德伯爾生物技術有限公司；固相萃取裝置，購自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.3 前處理實驗方法

1.3.1 現行行業標準 （kj201701） 樣本的提取：準確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）置于15 mL 具塞離心管中，用紅色油性筆標記，依次加入1 mL飽和氯化鈉溶液，0.2 mL 鹽酸羥胺溶液，2 mL 乙酸鹽緩沖液及6 mL 乙腈，渦旋提取2 min（食品快速檢測方法數據庫，2021）。 氧化和濃縮： 加入1 g 無水硫酸鈉，1 g 中性氧化鋁， 渦旋混合1 min，以4600 r/min 離心5 min。 準確移取5 mL 上清液于15 mL 離心管中， 加入1 mL 正已烷， 充分混勻，以4600 r/min 離心1 min。 準確移取4 mL 下層液于15 mL 離心管中， 加入100 μL 二氯二氰基苯醌溶液，渦旋混勻，反應1 min，于55 ℃水浴中氮氣吹干。 復溶：精密加入200 μL 復溶液，渦旋混合1 min，作為待測液，立即測定。

1.3.2 氮吹改良方法 樣本的提取：稱取去皮、去脂肪并均質的樣本5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管，加入適量的標準品，依次加入3 mL 飽和氯化鈉溶液， 7 mL 乙酸乙酯，于振蕩器上劇烈振蕩3 min，4000 r/min 離心5 min； 氧化和濃縮：取上清4 mL 于7 mL 離心管中， 加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振蕩混勻后， 置于氮吹儀中，65 ℃加熱吹干；復溶和凈化：取出上述7 mL離心管， 加入2 mL 正己烷， 輕輕振蕩至溶解殘渣，再加入0.8 mL 0.5%吐溫-20 水溶液，于振蕩器上劇烈振蕩1 min，4000 r/min 離心1 min。取出離心管后，去除上層正己烷，下層溶液即為待測液。

1.3.3 反萃取方法 樣本的提取方法同1.3.2；氧化和調整極性：取上清4 mL 于15 mL 離心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液，振蕩混勻后，加入10 mL 正己烷，于振蕩器上劇烈振蕩3 min；反萃取：取出上述15 mL 離心管，加入500 μL 0.2 mol/L 硼酸溶液， 于振蕩器上劇烈振蕩1 min，4000 r/min 離心1 min， 去除上層有機相，取下層溶液400 μL 于2 mL 離心管中，再加入400 μL 0.05 mol/L 四硼酸鈉溶液， 混勻后即為待測液。

1.3.4 SPE 柱法 樣本的提取方法同1.3.2；氧化和調整極性：取上清4 mL 于15 mL 離心管中，加入100 μL 0.1%四氯苯醌-乙腈溶液， 振蕩混勻后， 加入10 mL 正己烷， 于振蕩器上劇烈振蕩3 min；SPE 吸附：將上述液體按0.6 mL/min 的速度，勻速過HLB 小柱；SPE 洗脫： 加入1 mL 10%甲醇-水溶液于上述SPE 柱中， 按每秒一滴的速度勻速洗脫，洗脫液即為待測液。

1.4 質控實驗 每種樣品同時進行空白實驗和加標質控實驗。

1.4.1 空白實驗 稱取魚肉樣本， 按照1.3 中不同方法進行樣本制備。

1.4.2 加標質控實驗 準確稱取空白樣本適量，按照梯度加入一定量的孔雀石綠標準液， 使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL；準確稱取空白樣本適量， 按照梯度加入一定量的隱性孔雀石綠標準液，使孔雀石綠濃度為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL。

1.5 膠體金免疫層析試紙條使用方法及判讀示意圖

1.5.1 使用方法 （1）從原包裝鋁箔袋中取出檢測卡和酶標孔，恢復至室溫；（2）用移液器吸取待檢樣品溶液100 μL 于酶標孔中， 反復吹打至孔內紅色物質完全溶解，等待反應2 min；（3）將檢測卡平放，吸取孔內所有溶液滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；（4）反應5 min 根據示意圖判斷結果，其他時間判讀無效。

1.5.2 結果判讀 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖如圖1 所示。 陰性結果：T 線比C 線深，或一樣深，表示樣本中孔雀石綠濃度低于其檢測限；陽性結果：T 線比C 線淺，或T 線顯綠色，表示樣本中孔雀石綠濃度高于其檢測限；無效反應：如果測試結果C 線未出現，表示此試劑已失效。

圖1 膠體金免疫層析試紙條判讀示意圖

2 結果與分析

2.1 靈敏度比對 分別用行標法以及本實驗中的三種前處理方法進行最低檢測限，其中氮吹的最低檢測限最低，為隱性孔雀石綠0.5 ng/mL。 SPE 方法的最低檢測限為隱性孔雀石綠1 ng/mL。 反萃取方法和行標法的最低檢測限最高，為隱性孔雀石綠2 ng/mL（圖2）。

圖2 不同濃度的LMG 檢測結果

2.2 四種方法準確性比對 分別測試了行標法以及本實驗中三種前處理方法的準確性， 在0、0.25、0.5、1、2、4 ng/mL 六種加標濃度下， 每種方法每個濃度分別測試20 份樣本，每種濃度下顯示的陰陽性數量如表1。 在陰性、檢出限及2 倍檢出限這三個濃度點上， 四種方法的準確性均為100%；特別考察了半數檢出限的準確性，其中改良氮吹法準確性最高，假陽性率為10%，行標法假陽性率為15%，反萃取法假陽性率為25%，SPE方法假陽性率最高，為40%。

表1 四種方法不同濃度下的陰陽性數量

2.3 行標法及改良的三種方法前處理用時比對分別對比了行標法以及本實驗中三種前處理方法的用時，結果見表2。 其中，反萃取法由于省略了氮吹、過柱等步驟，用時最短，只需要23 min；SPE 法過柱洗脫時間明顯短于氮吹濃縮的時間， 用時32 min； 改良氮吹法相對于行標法減少了試劑加入量，且乙酸乙酯揮發更快，用時41 min；行標法用時最長，需要48 min。

表2 四種方法前處理用時 min

3 討論

試劑盒是否能用于臨床檢驗， 一般通過準確率、假陽性率、假陰性率、變異系數、提取率、特異性、操作步驟和檢測時間來判斷（李菊等，2020）。在膠體金檢測卡的開發中， 主要考量的是準確性和靈敏度，而對于膠體金的廣泛使用，前處理的工藝顯得尤為重要，在操作步驟、提取率和提取時間上的優化，能夠使檢測變得更快捷，更易于基層推廣使用。

根據GB31650-2019，孔雀石綠為0.5 ng/mL，行業快檢要求檢測限孔雀石綠為2 ng/mL。 本文對三種同時檢測隱性孔雀石綠前處理方法進行研究和比較， 該三種方法都能達到同時檢測隱性孔雀石綠效果。 其中改良氮吹法的最低檢測限能達到國標方法的最低檢測限，反萃取方法和SPE 方法的最低檢測限也都符合國家快檢方法的最低檢測限要求。相比于國標方法，該三種方法無論從時間、成本、操作難度等方面，都具有很大優勢，對我國水產養殖行業的監管具有積極意義。

反向萃取法用時最短， 提取率較其他兩種方法偏低。SPE 方法油脂等雜質去除的最干凈，但成本高，操作要求嚴格。 改良氮吹方法提取率最高，但用時較長。

本實驗對三種前處理方法與行標法進行對比，在陰性、 檢出限及2 倍檢出限這三個濃度點上，四種方法的準確性均為100%； 半數檢出限的準確性存在較大差異， 其中改良氮吹法準確性最高，假陽性率為10%，行標法假陽性率為15%，反萃取法假陽性率為25%，SPE 方法假陽性率最高，為40%。 出現半數檢出限假陽性的原因可能是氮吹后油脂殘留過多，SPE 過柱時流速不穩定等原因造成的。 但具體的影響因素和影響機理，如何減弱或盡量避免這些影響因素， 都有待進一步研究。

反向萃取法從樣品提取到檢測，用時最短，總時間不超過45 min，在限值范圍內，準確率最高，能夠避免使用其他大型儀器， 方便基層的快速使用，使建立第三方快速檢測實驗室成為可能。