基于VEGF信號通路研究苗藥血脈通對腦出血大鼠腦組織細胞自噬與凋亡的作用*

饒斌 查昀 鐘蕾 姚益群

(1.黃石市第五醫院，湖北 黃石 420204；2.黃石市中心醫院， 湖北 黃石 435000)

腦出血是臨床上常見的腦卒中亞型，是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血[1]。全世界范圍內每年腦出血發病人數約為兩百萬，且具有較高的病死率，而存活的患者也常常遺留有嚴重的神經功能障礙，容易對患者的身體及心理造成不良影響，也給患者及其家屬帶來沉重的經濟負擔[2]。現在臨床上多采用西藥或手術方式對腦出血患者進行治療，但是這兩種方法都療效欠佳，因此，找到一種有效可行的治療方案迫在眉睫[3]。近年來，中藥治療腦出血在臨床上取得了一定的成果，中醫認為腦出血的病理基礎是淤血，因此治療腦出血的關鍵在于活血化瘀[4]。苗藥血脈通是苗族醫藥根據活血化瘀相關理論自擬組方成藥，具有化瘀的作用，常用于治療因淤血閉阻引起的胸痹、癥見胸悶、胸痛、心悸及冠心病心絞痛等疾病，且取得了很好的臨床治療效果[5-6]。然而，人們對于其在腦出血中的應用研究較少，因此，本研究采用苗藥血脈通治療腦出血模型大鼠，基于血管內皮生長因子(VEGF)信號通路探究苗藥血脈通對大鼠腦出血模型腦組織細胞自噬、凋亡的作用，為臨床治療腦出血提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 正常Wistar雄性清潔級大鼠50只，體重在240～260 g之間，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022。隨機選取12只作為假手術組，剩余大鼠用于腦出血造模。

1.2 實驗試劑及儀器 血脈通膠囊(貴州益康制藥有限公司)，其成分有丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等；PIK3、AKT、SCDF-1α、CXCR兔抗大鼠多克隆免疫組化檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)；ELISA檢測試劑盒(美國賽默飛公司)；Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4一抗(美國艾美捷科技有限公司)；光學顯微鏡(上光中恒公司)；倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；離心機(江蘇賽德力制藥機械制造有限公司)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 造模方式

1.3.1 腦出血大鼠模型制備 采用Rosenberg法制備腦出血模型[7]。以10%水合氯醛(400 mg/kg)經腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定在立體儀上，于頭部正中間進行縱橫切口，隨后將大鼠骨膜剝離，使其冠狀縫和前囟裸露。在大鼠前囟之前約1.0 mm、中線右側約3.0 mm處鉆一個直徑約為1.0 mm的小孔。采用微量注射器從股動脈抽取適量的血液，借助立體定向儀沿鉆孔垂直進針6.0 mm左右，緩慢注血80 μL，將針留置10 min后撤針，采用消毒針縫合切口。模型組、治療組均造模，假手術組僅僅裸露頸總動脈、神經。

1.3.2 腦出血大鼠模型造模成功檢驗標準 以造模大鼠清醒后出現同側Horner征作為腦出血大鼠模型制備成功，即出現沒有方向性的自主運動、提尾時向右側旋轉、會自行向右轉圈、右前肢發生癱瘓或者右前肢內收、腕屈曲，曲頭朝向右側背部。本研究中造模成功大鼠只數為36只。

1.4 藥物干預 將造模成功的大鼠隨機分為3組，分別為腦出血組、給藥A組和給藥B組，每組12只。其中6只用于測定出血病灶體積，6只用于測定各蛋白陽性表達及細胞凋亡情況。大鼠的給藥方式為灌胃，從造模后第二天開始，給藥組A組和B組大鼠均連續給藥35 d，給藥量分別為15 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，假手術組及腦出血組大鼠均在相同時間予以等量的生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1 細胞凋亡變化 各組大鼠在給藥35 d后，于最后給藥的4 h后，采用乙醚將大鼠麻醉后斷頭處理，選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，將其置于10%CH3CHO中于4 ℃冰箱固定48 h，隨后進行石蠟包埋，采用組織切片機制備5 μm厚度的冠狀切片，經常規脫蠟、乙醇脫水。采用TUNEL法利用檢測試劑盒按照說明書進行細胞凋亡檢測，利用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的變化，凋亡細胞以細胞核呈棕黃色著色為陽性細胞，在高倍鏡下選取5個區域，各計數100 mm3范圍內陽性細胞數，取5個區域平均值作為各組大鼠腦組織陽性細胞數。

1.5.2 出血病灶體積測定 選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，多聚甲醛固定，在灌狀面連續切片(厚度為20 μm)，測量出血區最大切面的長和寬，采用如下公式計算各組大鼠血腫體積。總病灶體積=1/2×A×B×C(其中A代表血腫長徑，B表血腫寬徑，C代表血腫層數)。

1.5.3 Western blot法檢測Beclin-1、VEGF、SCDF-1α、CXCR-4蛋白表達 提取總蛋白，采用BCA檢測試劑盒，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜，于水平搖床室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育2 h，ECL系統顯色。運用凝膠成像分析系統測量各陽性條帶的吸光度，以β-actin為內參照，將吸光度的比值作為蛋白的相對表達量。

1.5.4 免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達 常規對腦組織石蠟切片脫蠟后用3%過氧化氫蒸餾水洗3次并進行熱修復抗原。首先，滴加正常血清封閉液37 ℃ 20 min；第二次，滴加稀釋的一抗，37 ℃ 60 min后4 ℃過夜，PBS洗滌；第三次，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 20 min后采用PBS洗滌后用DAB顯色、脫色、透片、封片。采用HPIAS-1000高清晰彩色病例圖片分析系統進行圖像分析。PI3K、AKT陽性細胞數的定量分析采用顯微鏡計數法，隨機選取5個高倍鏡視野，統計其陽性細胞數，取其平均值作為計數結果。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡變化比較 治療后，腦出血組、給藥A組及給藥B組大鼠腦組織陽性細胞數均明顯多于假手術組(P<0.05)；給藥A組陽性細胞數為(93.76±12.73)個，給藥B組陽性細胞數為(79.65±9.97)個，均顯著低于腦出血組的(124.75±11.33)個，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 治療后各組大鼠腦組織陽性細胞數

2.2 各組腦出血病灶體積測定比較 假手術組大鼠腦組織未出現腦出血病灶，給藥A組腦出血病灶體積為(35.06±6.03)mm3，給藥B組腦出血病灶體積為(8.36±3.65)mm3，均顯著低于腦出血組的(55.51±7.31)mm3，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠腦出血病灶體積變化

2.3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達量比較 腦出血組Beclin-1、VEGF蛋白表達量均明顯高于假手術組(P<0.05)；給藥A組及B組Beclin-1、VEGF蛋白表達量均高于腦出血組(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組大鼠Beclin-1、VEGF蛋白表達量

2.4 各組免疫組化檢測PI3K、AKT蛋白表達水平比較 腦出血組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達吸光度均高于假手術組(P<0.05)；給藥A組及B組大鼠PI3K、AKT蛋白陽性表達吸光度均高于腦出血組(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠PI3K蛋白陽性表達吸光度(200×)

圖5 各組大鼠AKT蛋白陽性表達吸光度(200×)

2.5 各組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達比較 腦出血組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達量均高于假手術組(P<0.05)；給藥A組及B組大鼠CXCR-4、SCDF-1α蛋白表達量均高于腦出血組(P<0.05)，見圖6。

3 討論

中醫認為腦出血的病理基礎是淤血，治療腦出血的關鍵在于活血化瘀[8]。臨床上，苗藥血脈通常用于治療因淤血閉阻引起的各類疾病，包括胸痹、癥見胸悶、心悸及冠心病心絞痛等疾病，被證實具有較好的活血化瘀作用。在本研究中，予以腦出血模型大鼠苗藥血脈通治療后，其腦組織細胞凋亡數及大鼠腦出血病灶體積均顯著低于腦出血組，提示苗藥血脈通用于治療腦出血具有很好的療效。VEGF是促血管生成因子，能與細胞內皮細胞膜上的相應受體結合進而引發下游信號級聯，促進血管新生[9]。而大量研究表明腦出血的發生和發展與VEGF及其相應信號通路密切相關[10]。

圖6 各組大鼠CXCR-4、SCDF-α蛋白表達量

自噬是真核細胞降解和再循環胞質內容物的主要途徑，在維護細胞內環境穩態方面起到很重要的作用[11-12]。Beclin-1作為酵母Atg6/ps30基因的同源物之一，能作為檢測自噬活動的標記蛋白[13]。與自噬密切相關的Beclin-1蛋白及SCDF-α/CXCR4通路都在腦出血中發揮著重要的生物效應，兩者的交點重要信號通路為PI3K/AKT信號轉導通路。在發生腦出血后，機體自身能夠釋放出一些能將具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質，其能與PI3K的調節亞基特異性結合，激活PI3K。AKT作為PI3K下游的效應分子，能與PI3K結合，從而使AKT從細胞質向細胞膜轉位，并改變其構象，使AKT的Thr308及Ser473位點發生磷酸化，將AKT由抑制狀態轉變為激活狀態[14]。AKT活化后即成為p-AKT，p-AKT表達量可用于衡量PI3K/AKT信號轉導通路的活化程度，通過參與PI3K/AKT信號轉導通路促進細胞增殖和阻止細胞凋亡的發生[15]。

SCDF-α/CXCR4信號軸是指趨化因子SCDF-α結合其特異性受體CXCR4的N端，隨后通過多種方式實現PI3K/AKT信號轉導通路的激活，從而影響細胞的生長、趨化及血管生成等生物效應[16]。SCDF-α/CXCR4信號軸在腦出血損傷中，不僅能調控內源性細胞遷移，促進新生血管的形成，通過增強機體抗氧化能力抑制細胞凋亡，實現腦保護作用，還能調控細胞自噬作用，從而實現對細胞凋亡的調控[17]。當機體內CXCR4表達下調時，作為自噬啟動因子的PI3KmRNA及其相應蛋白PI3K表達也下調。也就是說，CXCR4/PI3K自噬軸信號傳導通路不僅能激發細胞自噬，還能調控細胞自噬狀態[18]。

在腦血管內皮細胞中，PI3K/AKT信號轉導通路是直接調節VEGF基因表達的重要信號通路之一。相關研究表明，抑制PI3K/AKT的活性，能有效抑制VEGF的表達，證實VEGF表達確實由PI3K/AKT信號轉導通路所調控[19]。苗藥血脈通主要成分為丹參、澤瀉、葛根、野鴨椿、川穹、赤芍、桂枝等，具有增強微血管抗損傷的功效及出色的神經保護功能。腦出血大鼠經苗藥血脈通治療后，相比較于腦出血組，給藥組大鼠細胞凋亡數、腦出血病灶體積顯著降低，Beclin-1、VEGF、PI3K、AKT、SCDF-α、CXCR-4等蛋白表達量顯著升高，提示苗藥血脈通能夠通過影響腦出血大鼠腦組織自噬狀態來調節大鼠神經功能，其可能的機制為予以大鼠苗藥血脈通后能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路，增加VEGF蛋白表達量，進而激活大鼠體內PI3K/AKT信號轉導通路，PI3K磷酸化后導致PI3K減少，從而使得與PI3K形成復合物的Beclin-1表達量相應減少，因而有效提升細胞自噬能力，隨后CXCR4與磷酸化的PI3K結合形成CXCR4/PI3K自噬軸，影響自噬活動，抑制細胞凋亡。

4 結論

苗藥血脈通能夠激活腦出血大鼠VEGF信號通路，既能激發細胞自噬，又能夠調控細胞自噬狀態，實現抑制細胞凋亡的腦保護作用，為臨床治療腦出血提供了新的思路。