香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥中的差異甲基化基因篩選及功能分析*

李萍 陳磊 楊梅 彭俊杰 文富強

(四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041)

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種以持續(xù)呼吸道癥狀和氣流受限為特征的慢性疾病[1-2]。目前認(rèn)為，吸煙是慢阻肺最主要的危險因素之一，香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)是慢阻肺的主要病理基礎(chǔ)[1,3-4]，但其分子機制仍有待闡明。表觀遺傳指在不改變DNA序列的情況下，使遺傳表型發(fā)生變化。表觀遺傳修飾是基因調(diào)控的重要機制[5]。近年來研究表明，DNA甲基化，作為一種常見的表觀遺傳修飾，與慢阻肺易感性、急性加重及預(yù)后密切相關(guān)[6]，且香煙煙霧可直接導(dǎo)致氣道DNA甲基化的改變[7]，說明DNA甲基化可能介導(dǎo)機體對(內(nèi))外環(huán)境的刺激，進(jìn)而參與慢阻肺的炎癥反應(yīng)過程[8-9]，但目前關(guān)于DNA甲基化在香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥中的變化和作用機制尚不完全清楚。本研究擬通過構(gòu)建香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道炎癥小鼠模型，利用全基因組甲基化捕獲測序技術(shù)，篩選其炎癥反應(yīng)過程中的差異甲基化基因，并初步分析基因功能，為深入探討甲基化修飾在慢阻肺中的調(diào)控作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級C57BL/6系雄性小鼠(7～9周齡，體重20～22 g)購自四川大學(xué)實驗動物中心?？侱NA提取試劑盒購自Qiagen公司，甲基化試劑盒購自Agilent公司。

1.2 模型構(gòu)建與取材 參照文獻(xiàn)[10]將20只小鼠隨機分為對照組(WT)與熏煙組(CS)，每組10只，分別暴露于過濾空氣和香煙煙霧，每次2 h，每天兩次，每周6 d，連續(xù)4 w。所有小鼠在暴露4 w后的第1天被放血處死，取小鼠右肺組織，4%多聚甲醛(pH 7.4)固定，常規(guī)石蠟包埋；左肺組織裝入液氮預(yù)冷的離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)移至液氮凍存。

1.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟包塊切片(4 mm厚)，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠氣道的形態(tài)學(xué)變化和炎癥反應(yīng)程度。

1.4 DNA提取 每組隨機選取3只小鼠的液氮凍存肺組織，按照DNA提取試劑盒說明書提取肺組織總DNA，確定A260/280比值在1.8～2.0之間的DNA樣本進(jìn)行甲基化測序。

1.5 全基因組甲基化捕獲測序 基于Agilent SureSelectXT甲基化測序 (Methyl-Seq)靶向捕獲序列，對捕獲的DNA片段使用Illumina Novaseq PE150進(jìn)行測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Fastp軟件(1.2.1版)、Bismark軟件 (0.19.0版)識別DMR，DMR是指基因組中甲基化修飾水平具有顯著差異的基因組區(qū)域，在對基因表達(dá)調(diào)控具有關(guān)鍵作用。使用methylKit軟件(1.6.1版)計算差值甲基化的P值。DMR定義為調(diào)整后P<0.05，甲基化率差異大于5%。并對DMR進(jìn)行區(qū)域、基因注釋，獲得差異甲基化基因(DMG)。

1.6 生物信息分析 使用ClusterProfiler算法，將包含啟動子甲基化改變的DMG進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能分析，同時根據(jù)京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)進(jìn)行通路富集分析，得到具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的生物學(xué)過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥 HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，熏煙組的小鼠支氣管上皮細(xì)胞增生、支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥(400×)

2.2 甲基化捕獲測序結(jié)果 熱圖(Heatmap)顯示，熏煙組與對照組的全基因組DNA甲基化譜呈現(xiàn)顯著不同(圖2)。數(shù)據(jù)分析顯示，篩選出DMR 2569個，其中低甲基化 1309個，高甲基化1260 個。通過基因注釋，獲得DMG 2002個，其中包含啟動子甲基化改變的DMG共565個。按照統(tǒng)計學(xué)顯著性排序，分別列出包含啟動子高甲基化(前10位)和低甲基化(前10位)的DMG，見表1。

2.3 GO和KEGG富集分析 GO分析發(fā)現(xiàn)DMG相關(guān)的生物學(xué)過程主要富集于細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、代謝過程等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)DMG相關(guān)的信號通路主要富集于Wnt、Hippo、Rap1等信號通路，見圖3。

3 討論

吸煙是慢阻肺的最主要危險因素之一。本研究的結(jié)果顯示香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥的同時，改變了目標(biāo)基因群的甲基化狀態(tài)，后者參與了多個生物學(xué)過程和信號調(diào)控。

最近的研究證實慢阻肺伴隨廣泛的代謝失調(diào)，包括脂質(zhì)代謝、糖脂代謝及谷氨酰胺代謝等[11-13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫模型中存在脂質(zhì)代謝[13]，同時香煙煙霧暴露可使人肺上皮細(xì)胞糖酵解減少，脂肪酸氧化增加[14]。本研究顯示多數(shù)DMG與代謝過程存在關(guān)聯(lián)，例如與代謝相關(guān)的Fth1、Mid1、Cd59a、Oas3等甲基化調(diào)控均可能參與其中。此外，DMG亦富集于細(xì)胞分化、細(xì)胞生長過程。氣道纖毛上皮細(xì)胞的分化和生長障礙在慢阻肺的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)鍵作用[15]，其機制也可能與異常甲基化調(diào)控有關(guān)。

圖2 對照組(WT)與熏煙組(CS)差異甲基化基因(DMGs)熱圖

表1 位于啟動子的差異甲基化基因(DMGs)列表

圖3 GO(A)和KEGG(B)分析結(jié)果圖

目前認(rèn)為免疫系統(tǒng)過度激活是慢阻肺氣道炎癥的特征之一[16]。其中，Wnt信號通路在免疫調(diào)節(jié)過程中常發(fā)揮重要作用[17-19]。肺組織表達(dá)多種Wnt配/受體及Wnt信號通路成分，香煙煙霧等損傷因素可激活Wnt通路[20-21]，后者進(jìn)一步參與慢阻肺的炎癥-免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖/凋亡等過程[3,20]。雖然目前缺乏Hippo信號通路在慢阻肺的研究，但已有研究證實Hippo信號通路與Wnt信號通路存在密切關(guān)聯(lián)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)DMG富集于Wnt和Hippo信號通路，提示甲基化調(diào)控可能參與Wnt-Hippo信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此外，Rap1可調(diào)節(jié)MAPK的活性，后者作為慢阻肺的“經(jīng)典信號分子[20-23]，促進(jìn)炎癥因子的釋放，進(jìn)而參與慢阻肺的炎癥過程[24]，其調(diào)控機制仍然可能與目標(biāo)基因異常甲基化相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究表明，香煙煙霧誘導(dǎo)氣道炎癥的過程中，伴隨目標(biāo)基因群的甲基化改變，后者進(jìn)一步參與調(diào)控多個與“炎癥”有關(guān)的生物學(xué)過程和信號通路?；诖耍谆揎椏赡茉?吸煙有關(guān)的)慢阻肺氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，但其機制仍有待進(jìn)一步研究。