過氧化氫誘導的草魚原代肝細胞氧化損傷模型的構建及其對天然植物抗氧化能力的評價

石瑤瑤 葉元土* 蔣 蓉 蔡春芳 吳 萍

(1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇省水產動物與營養重點實驗室，蘇州 2215123；2.無錫三智生物科技有限公司，無錫 2214135)

水產動物受到體內與體外環境的影響會產生過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，包括自由基形式(超氧陰離子自由基、羥基自由基)和非自由基形式[過氧化氫(H2O2)、次溴酸等][1]。由ROS引起的氧化應激和氧化損傷是危害水產動物生理健康的主要因素，針對ROS的研究主要包括不同種類ROS對細胞、器官組織和機體的損傷作用及其作用路徑，以及如何提高水產動物抗氧化應激能力，例如，篩選適用于水產動物抗氧化應激、抗氧化損傷作用物質的研究，這也是現代養殖學和營養學研究的重要領域之一。

利用離體細胞氧化損傷模型研究ROS的作用機制，并利用細胞氧化損傷模型篩選抗氧化損傷物質是較為有效的技術方法，其中H2O2損傷細胞模型是常用的細胞氧化損傷模型[2]。H2O2是一種常見的活性氧，極易透過細胞膜導致細胞結構的氧化損傷或誘發細胞凋亡。因此H2O2是被用作細胞體外建立氧化損傷模型的常用試劑[3]。在細胞氧化損傷模型應用方面，一個重要的應用方向就是將對照組、模型組和“造模劑+受試物”試驗組在相同條件下進行試驗，篩選和評價“受試物”抗氧化應激的能力、對氧化損傷的修復能力，最終篩選出有效的受試物應用于細胞、動物的抗氧化應激和氧化損傷修復。

一些植物多酚含量高的天然植物是抗氧化應激、氧化損傷修復受試物的主要來源，依賴其中含有的植物多酚(如多酚酸和多酚黃酮類物質)實現對ROS的清除，并對受到氧化損傷的細胞或器官組織進行修復[4]。

本試驗以H2O2為造模劑，以草魚的原代肝細胞為試驗對象，依據細胞存活率與細胞形態變化、培養液中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)活性、細胞中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、細胞凋亡率等指標，探索最佳的H2O2濃度及干預時間，旨在建立一種可靠性好、重復性高的H2O2誘導的草魚原代肝細胞氧化損傷模型，并利用構建的草魚原代肝細胞氧化損傷模型對8種天然植物的抗氧化能力進行綜合評價，篩選具有較強抗氧化活性的天然植物。

1 材料與方法

1.1 試驗草魚

試驗用草魚為1冬齡草魚幼魚，體重為20～30 g/尾，飼養于蘇州大學室內養殖系統中。使用自制的含28%蛋白質、4%油脂的飼料喂養，每天按時投喂1次。

1.2 肝細胞氧化損傷模型的構建

1.2.1 H2O2的配制和使用

無菌條件下，吸取20 μL 30%的H2O2(中國醫藥集團有限公司)與1 880 μL的無菌三蒸水均勻混合，將H2O2稀釋100倍。分別吸取1、2、4和6 μL的H2O2溶液到1 mL的培養基中，混合均勻，制成終濃度為100、200、400和600 μmol/L的H2O2造模劑。

1.2.2 肝細胞的分離與培養

草魚原代肝細胞的分離參照秦潔等[5]的試驗方法并稍作調整。草魚用0.01%高錳酸鉀溶液浸泡15 min，常規解剖取出肝臟，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L、pH 7.4)清洗3遍去除多余組織塊后，剪成1 mm3大小的顆粒，按照體積1∶3的比例加入0.25%的胰蛋白酶，27 ℃控溫搖床消化15 min，終止消化后1 000 r/min離心1 min，棄掉上清液。按1∶3的比例加入PBS和紅細胞裂解液，1 000 r/min離心4 min棄掉上清液。PBS清洗細胞2次，800 r/min離心1 min棄掉上清液，加入含10%胎牛血清的M199培養基制成細胞懸液，于5% CO2、27 ℃的培養箱中培養，24 h后換完全培養液。

1.2.3 細胞分組及處理

取培養24 h后處于對數生長期的細胞(細胞貼壁生長且貼壁細胞約占80%的培養板面積)，分組后分別用終濃度為0(對照組)、100、200、400、600 μmol/L的H2O2處理細胞0.5、1.0、2.0、4.0 h后進行后續試驗。

1.2.4 細胞存活率的測定

接種2.5×105個細胞到96孔板中，按照1.2.3的分組處理細胞后換上正常培養液，每孔加入10 μL噻唑藍(MTT)溶液，繼續培養4 h后棄去舊培養液，每孔加入100 μL純度為99.5%的二甲基亞砜(DMSO)，遮光振搖10 min，充分溶解甲瓚(formazan)。用酶標儀檢測570 nm波長下各孔的吸光度值(OD570 nm)，計算細胞存活率，數據用百分比表示(平均值±標準差)。細胞存活率的計算公式如下：

細胞存活率(%)=(試驗組OD570 nm/
對照組OD570 nm)×100。

1.2.5 培養液中LDH活性的檢測

細胞分組處理方法同1.2.3，分別收集不同濃度H2O2、不同處理時間的培養基上清液。按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)所述方法，用酶標儀在450 nm波長下檢測LDH活性。

1.2.6 細胞形態學觀察

生長對數期的細胞經不同濃度的H2O2處理1 h后用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態變化并拍照。

1.2.7 細胞中MDA含量、SOD活性的檢測

細胞分組處理方法同1.2.3，接種2.5×106個細胞到24孔板中，不同濃度的H2O2處理1 h。將細胞收集在1.5 mL離心管中，1 000×g離心4 min，棄掉上清液后用PBS清洗1次。加入200 μL的細胞裂解液，重懸細胞，裂解30 min，13 000×g離心10 min取上清液，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)所述方法檢測MDA含量和SOD活性。

1.2.8 細胞凋亡率和細胞中ROS水平的檢測

細胞收集方法同1.2.7，細胞凋亡率試驗按照Annexin V-FITC/PI試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司生產)說明書，ROS水平按照ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)所述方法，均使用流式細胞儀進行檢測。

1.3 天然植物抗氧化能力的評價

1.3.1 8種天然植物

依據前期預試驗和有關中藥的文獻報道[6-10]，選擇訶子(TerminaliachebulaRetz)、虎杖(PolygoniCuspidatiRhizomaetRadix)、荷葉(Foliumnelumbinis)、車前草(Plantaginisherba)、側柏葉(Platycladicacumen)、甘草(GlycyrrhizaeRadixetRhizoma)、大黃(RheiRadixetRhizoma)和肉桂(Cinnamomicortex)共8種天然植物(中藥飲片，且均為植物原粉)，利用所建立的肝細胞氧化損傷模型評價其抗氧化能力。

1.3.2 天然植物水提物的制備

將8種天然植物飲片分別用粉碎機粉碎，過60目篩，各稱取一定量的粉末，按料液比1∶10加入雙蒸水，攪拌均勻，4 ℃浸泡24 h，用濾膜過濾2遍，將濾液放入冷凍干燥機，制成粉末，-80 ℃冷凍保存待用。

1.3.3 天然植物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力的測定

清除DPPH自由基能力參照陳旭丹等[11]和王萍等[12]的方法測定并稍作改進。將DPPH溶于無水乙醇中，配成終濃度為8.62×10-5mol/L的DPPH溶液。分別稱取0.128 g待測樣品，加入20 mL 75%乙醇，超聲提取5 min，8 000 r/min離心8 min，收集上清液，得到初始濃度為6.4 g/L的待測液母液，用無水乙醇稀釋成不同濃度。待測液與DPPH溶液各2 mL避光靜置30 min，517 nm處測定吸光度值(Ai)；待測液與無水乙醇各2 mL做參比，517 nm處測定吸光度值(Aj)；DPPH溶液與無水乙醇各2 mL做空白，517 nm處測定吸光度值(A0)。每個樣品做3個平行。按照下列公式計算DPPH清除率：

S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

式中：S為DPPH自由基清除率；Aj為待測液在517 nm處的吸光度值；Ai為加入DPPH溶液后待測液在517 nm處的吸光度值；A0為DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。

IC50定義為：自由基數目減少50%時所需要的樣品濃度，即為自由基清除率為50%時樣品的濃度。根據樣品濃度和對應的DPPH清除率繪圖，得出公式，計算IC50。

1.3.4 天然植物對H2O2損傷細胞活性的測定

將細胞培養24 h之后分為對照組、模型組、試驗組。對照組換正常培養液，模型組和試驗組換含200 μmol/L H2O2的培養液，處理細胞1 h，棄掉培養液，試驗組分別加入含不同濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)天然植物水提物的培養液，培養12 h換正常培養液，采用MTT法檢測各組的吸光度值，以對照組為參照，計算各組細胞存活率。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較。試驗數據以平均值±標準差(mean±SD)表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 肝細胞氧化損傷模型的構建

2.1.1 細胞存活率

如圖1所示，4個處理時間(0.5、1.0、2.0、4.0 h)時細胞存活率均隨著H2O2濃度的增加而降低。100 μmol/L H2O2組細胞存活率在4個處理時間時均大于70%，細胞損傷程度不夠；而400和600 μmol/L H2O2組細胞存活率在4個處理時間時基本均小于50%，細胞壞死過多；200 μmol/L H2O2處理1.0～4.0 h時細胞存活率均降到50%～70%，可作為誘導氧化損傷模型的H2O2濃度。200 μmol/L H2O2處理1.0 h時細胞存活率為(64.85±0.38)%，且符合細胞損傷程度，可作為肝細胞氧化損傷模型建立的條件。

圖1 H2O2對細胞存活率的影響

2.1.2 培養液中LDH活性

如圖2所示，4個處理時間時LDH活性均隨H2O2濃度的增加先上升后趨于穩定。與對照組相比，200、400、600 μmol/L H2O2組LDH活性在4個處理時間時均出現顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且200、400、600 μmol/L H2O2組之間沒有顯著差異(P>0.05)。200 μmol/L H2O2處理細胞1.0 h后培養液中LDH活性為(505.67±10.49) U/L，與對照組相比極顯著升高(P<0.01)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.1.3 細胞形態學變化

不同濃度H2O2處理細胞1 h后倒置顯微鏡觀察情況如圖3所示。對照組的細胞生長狀況良好，細胞團細胞密度高，呈現圓形或橢圓形，形態飽滿，細胞膜邊緣清晰(圖3-A)。隨著H2O2濃度的增加，細胞體積逐漸變小，細胞膜出現破裂，邊緣模糊，細胞貼壁不牢。100 μmol/L H2O2組細胞較對照組無明顯變化(圖3-B)。200 μmol/L H2O2組部分細胞出現細胞膜邊緣模糊，細胞少量皺縮，大多數細胞呈現完整細胞狀態(圖3-C)。400 μmol/L H2O2組部分細胞皺縮，胞內顆粒物增多，出現些許細胞碎片(圖3-D)。600 μmol/L H2O2組細胞碎片很多，細胞凋亡壞死嚴重(圖3-E)。

2.1.4 細胞中MDA含量、SOD活性

不同濃度的H2O2處理細胞1 h后，細胞中MDA含量及SOD活性如表1所示。與對照組相比，各濃度H2O2組細胞中SOD活性均極顯著下降(P<0.01)，其中200 μmol/L H2O2組SOD活性為(57.55±1.20) U/mg prot，降低了24.50%。隨著H2O2濃度的增加，細胞中MDA含量逐漸升高，在H2O2濃度達到200 μmol/L時開始出現顯著升高(P<0.05)，之后保持穩定。

2.1.5 細胞凋亡率

如圖4-A所示，不同濃度H2O2處理細胞1 h后，流式細胞儀分析結果顯示，與對照組相比，100 μmol/L H2O2組細胞已經有明顯的凋亡，隨著H2O2濃度的增加，凋亡細胞數量逐漸增多，400～600 μmol/L H2O2組晚期凋亡和壞死細胞明顯增多。如圖4-B所示，100、 200、400和600 μmol/L H2O2處理1 h后，細胞凋亡率分別為(21.29±1.62)%、(36.78±1.23)%、(53.82±3.56)%、(61.52±3.71)%，與對照組相比均極顯著升高(P<0.01)。

A圖為流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染結果；B圖為細胞凋亡率。

2.1.6 細胞中ROS水平

如圖5所示，H2O2濃度為0～200 μmol/L時細胞中ROS水平隨H2O2濃度的升高而升高，在200 μmol/L時達到最高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；H2O2濃度為400～600 μmol/L時細胞中ROS水平逐漸降低。100～600 μmol/L H2O2處理細胞1 h后，細胞中ROS水平用平均熒光強度來表示分別為62.0±4.0、103.7±2.5、109.3±1.5、87.0±6.3、66.3±3.0。

圖5 不同濃度H2O2對細胞中ROS水平的影響

2.2 天然植物抗氧化能力評價

2.2.1 8種天然植物清除DPPH自由基能力比較

清除自由基能力以IC50進行比較，IC50值越小表明樣品清除自由基能力越強，抗氧化能力越高。根據表2結果得知，訶子、虎杖、大黃、荷葉的清除DPPH自由基能力無顯著差異(P>0.05)，虎杖、大黃、荷葉、肉桂的清除DPPH自由基能力無顯著差異(P>0.05)。8種天然植物的清除DPPH自由基能力大小排序為訶子≥虎杖≥荷葉≥大黃≥肉桂>側柏葉>車前草>甘草。清除DPPH自由基能力最強的是訶子。

表2 8種天然植物的清除DPPH自由基能力

2.2.2 8種天然植物對H2O2損傷細胞存活率的影響

由表3結果可知，0.5、1.0、2.0 mg/mL組細胞存活率與模型組相比均有所提高且隨天然植物水提物濃度的升高而增加。濃度為0.5 mg/mL時，8種天然植物組的細胞存活率排序為訶子>肉桂>荷葉≥大黃≥虎杖≥側柏葉≥甘草≥車前草，細胞存活率分別為(140.84±0.07)%、(90.82±0.03)%、(65.68±0.02)%、(64.49±0.03)%、(60.58±0.02)%、(50.56±0.01)%、(53.50±0.06)%、(53.87±0.01)%。濃度為1.0 mg/mL時，8種天然植物組的細胞存活率排序為訶子>肉桂≥荷葉≥虎杖>側柏葉≥大黃≥甘草≥車前草，細胞存活率分別為(180.36±0.07)%、(90.38±0.04)%、(74.51±0.02)%、(73.27±0.04)%、(52.74±0.02)%、(61.27±0.04)%、(56.03±0.01)%、(58.77±0.03)%。濃度為2.0 mg/mL時，8種天然植物組的細胞存活率排序為訶子>虎杖≥肉桂≥荷葉>大黃≥側柏葉≥甘草≥車前草，細胞存活率分別為(211.34±0.05)%、(102.32±0.07)%、(94.58±0.04)%、(88.66±0.02)%、(76.95±0.05)%、(60.30±0.03)%、(59.49±0.02)%、(62.65±0.03)%。3個濃度下8種天然植物處理后的細胞存活率排序基本一致。訶子水提物在濃度為0.5 mg/mL時細胞存活率就能達到對照組水平，且比對照組高出40.84%；3個濃度的肉桂水提物均能使細胞存活率達到90%以上；訶子對損傷細胞的修復能力最強，最弱的為甘草和車前草。

表3 8種天然植物對H2O2損傷細胞存活率的影響(相對于對照組)

續表3項目 Items對照組 Control group模型組 Model group0.5 mg/mL組0.5 mg/mL group1.0 mg/mL組1.0 mg/mL group2.0 mg/mL組2.0 mg/mL group大黃 Rhei Radix et Rhizoma100.00±0.0853.62±0.0464.49±0.03c61.27±0.04c76.95±0.05d車前草Plantaginis herba100.00±0.0252.69±0.0253.87±0.01cd58.77±0.03d62.65±0.03de荷葉 Folium nelumbinis100.00±0.0546.83±0.0265.68±0.02c74.51±0.02bc88.66±0.02c側柏葉 Platycladi cacumen100.00±0.0344.48±0.0350.56±0.01cd52.74±0.02d60.30±0.03de甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma100.00±0.0752.35±0.0453.50±0.06cd56.03±0.01cd59.49±0.02de

3 討 論

3.1 H2O2誘導草魚原代肝細胞氧化損傷模型的條件

以H2O2作為造模劑構建體外氧化損傷模型的研究已經有很多報道，如人、大鼠、小鼠、建鯉、斜帶石斑魚等肝細胞或其他細胞的氧化損傷模型[13-16]，而關于建立草魚肝細胞氧化損傷模型的報道極少。由于細胞種類和性質不同，對外界應激的耐受程度不同，因此以H2O2為造模劑建模的標準和模型檢驗方法也不完全相同[17]。細胞存活率是表征細胞狀態的基礎指標，直接反映外界刺激對細胞的損傷程度。很多報道都以細胞存活率作為建?；A標準，細胞存活率不能過低或者過高，過低(<50%)表明大量細胞可能發生不可逆損傷，不利于氧化機制的研究；過高(>70%)則說明細胞狀態良好，沒造成明顯的氧化損傷，不利于后期試驗的進展[18]。細胞存活率在50%～70%時能作為建立模型的基礎標準。

檢驗建模成功與否的指標較多，包括LDH活性、MDA含量、SOD活性、ROS水平和細胞凋亡率等。LDH存在于活細胞胞漿中，當細胞膜受損時，LDH會滲出到細胞外，通過檢測培養液中LDH活性就可判斷細胞膜的完整性，從而判斷細胞損傷程度[19]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應后產生的，MDA含量的多少能夠反映機體脂質過氧化的程度，間接反映細胞的損傷程度[20]。SOD是體內重要的抗氧化酶，催化過氧陰離子發生歧化反應，清除多余自由基，作為各種器官組織中第1道抗氧化防御系統，防止自由基對細胞結構的損傷，SOD活性的變化能反映機體清除氧自由基的能力[21]。細胞中ROS水平和細胞凋亡率直接體現細胞的氧化應激水平。本試驗結果顯示，用200 μmol/L H2O2處理細胞1.0 h后，與對照組相比，培養液中LDH活性升高13.88%，細胞中MDA含量增加5.56%、SOD活性降低24.49%，細胞凋亡率增加68.08%，細胞中ROS水平增加43.28%，且與對照組的差異均達到顯著水平，該處理可作為建立草魚原代肝細胞氧化損傷模型的條件。

3.2 應用草魚原代肝細胞氧化損傷模型評價8種天然植物的抗氧化能力

植物多酚廣泛存在于天然植物中，多酚類化合物主要包括黃酮類化合物、酚酸類化合物，這也是植物提取物發揮抗氧化活性的主要成分。植物多酚的抗氧化作用體現在它能夠清除自由基、抑制氧化酶活性、提高抗氧化酶活性[22]。外源性的抗氧化劑能夠調節機體內抗氧化平衡，研究天然植物的抗氧化能力對抗氧化劑的篩選具有重要意義。

訶子的主要活性成分包括訶子多酚、鞣質類、三萜皂苷、訶子多糖等[23]；虎杖中主要含有蒽醌類、芪類、黃酮類和酚類等活性成分[24]；肉桂的主要活性成分是肉桂油，其中肉桂醛的含量是最高的，除此之外還有萜類、苯丙素類、酚苷類、黃酮類等活性成分[25]；大黃的主要活性成分包括大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚在內的游離蒽醌[26]；荷葉的主要活性成分包括多種生物堿類、黃酮類、揮發油類、多糖類有機酸類等[27]；車前草含有多糖類、黃酮類、萜類和揮發油等活性成分[28]；側柏葉中的主要活性成分是揮發油、黃酮、鞣質等[29]；甘草中的主要活性成分有三萜類、黃酮類和甘草多糖類[30]。8種天然植物都含有抗氧化多酚類化合物，多酚類化合物可通過氫自由基淬滅體內的ROS，抑制卵磷脂脂質過氧化損傷。多酚類化合物可激活抗氧化信號通路、緩解應激、調節抗氧化酶的表達，從而減少氧化損傷。訶子的多酚含量達到13.27%，這是8種天然植物中訶子的抗氧化能力最強的主要原因[31]。有關研究報道，訶子對小鼠有明顯的抗氧化作用，能夠保護肝細胞[32]。

通過細胞模型試驗評價天然植物的體外抗氧化能力，并結合化學分析法測定天然植物對自由基的清除能力，既能通過細胞模型試驗評價天然植物的抗氧化能力，又可以根據天然植物對損傷細胞的影響來檢測細胞模型建立的是否成功[33]。有文獻報道抗氧化能力即為清除相關自由基的能力[34]。通過進一步比較分析表2和表3的數據發現，8種天然植物水提物對氧化應激損傷細胞修復能力的強弱順序與8種天然植物清除DPPH自由基能力的高低順序基本一致。訶子的氧化損傷修復能力最強，0.5 mg/mL的訶子水提物修復損傷細胞12 h后，細胞存活率比對照組還高出40.84%；訶子的IC50值最小，清除DPPH自由基能力最高。0.5 mg/mL的車前草和甘草水提物修復損傷細胞12 h后，細胞存活率升高不明顯；車前草和甘草的IC50值最大，清除DPPH自由基能力最弱。以上結果表明天然植物對細胞氧化損傷修復作用與每種天然植物的抗氧化能力(清除DPPH自由基能力)的高低有關。

從本試驗結果分析，H2O2處理相同時間時，細胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低。同一濃度H2O2處理細胞，隨著處理時間的延長，細胞存活率有先降低后升高的趨勢。這可能是由于H2O2對細胞具有雙向反應，細胞隨時間變化對H2O2的削弱作用加強，從而刺激細胞增長。200 μmol/L H2O2處理1.0 h時細胞存活率為(64.85±0.38)%，符合建模要求的細胞存活率范圍(50%～70%)。從細胞形態來看，200 μmol/L H2O2組部分細胞出現細胞膜邊緣模糊，細胞少量皺縮，胞內顆粒變多，但大多數細胞呈現完整細胞狀態，利于后期抗氧化物質篩選的研究。細胞內ROS水平隨H2O2濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，可能是因為高濃度的H2O2導致大量細胞壞死，細胞破裂，未檢測到細胞內的ROS，具體機制還需進一步研究。在損傷后的細胞培養液中添加天然植物水提物能夠提高細胞的存活率，對損傷細胞具有一定的修復能力，且修復效果與天然植物本身抗氧化能力的高低有關，天然植物能夠修復氧化應激損傷的細胞，進一步驗證了本試驗所篩選的H2O2濃度和處理時間能成功構建草魚原代肝細胞氧化損傷模型。

4 結 論

① 以草魚原代肝細胞作為試驗對象，以含10%胎牛血清的M199培養基為培養液，在5% CO2、27 ℃培養條件下，以培養液中終濃度為200 μmol/L的H2O2為造模劑、處理肝細胞1 h，可以成功構建草魚原代肝細胞氧化損傷模型，模型特征為細胞存活率在50%～70%，細胞表現為明顯的氧化損傷，且出現細胞凋亡，細胞凋亡率在30%～50%。

② 本試驗利用H2O2構建的草魚原代肝細胞氧化損傷模型可以用于天然植物抗氧化能力的評價和抗氧化損傷修復天然植物的篩選，在所評價的8種天然植物中，以訶子的抗氧化能力最佳且氧化損傷修復能力最強。