蕎麥秸稈飼糧條件下甘露寡糖對灘羊瘤胃菌群結構的影響

馬秀花 桂瑞麒 焦 娜 楊萬宗 李慶敏 周玉香

(寧夏大學農學院，銀川 2750021)

反芻動物瘤胃的微生態系統極其復雜[1-2]，包括細菌、真菌和原生動物，而細菌是這些微生物中的優勢種群[3]。甘露寡糖(MOS)是一種常見的功能性低聚糖[4]，被稱為“化學益生素”，可以促進動物胃腸道內有益菌群的增殖[5-6]，改善動物胃腸道微生態環境，提高免疫力和生產性能[7]，在動物飼糧中得到廣泛使用[8]，并已成為多種單胃動物研究的主題，包括豬[9-10]、蛋雞[11]、肉雞[12]、家兔[13]，而其在反芻動物瘤胃微生物方面的研究較少[14]。普遍認為是低聚糖會被瘤胃微生物降解而不會對反芻動物飼糧帶來益處。然而，有研究發現，添加不同水平的MOS在不影響綿羊對絕大多數營養物質表觀消化率、存留率以及瘤胃發酵、免疫力、血清一氧化氮(NO)濃度和一氧化氮合酶活性的情況下提高了纖維物質的表觀消化率[15]，而關于MOS可提高綿羊纖維物質表觀消化率的生理機理還需要全面去揭示。因此，本研究基于16S rDNA高通量測序技術分析蕎麥秸稈飼糧條件下添加不同水平MOS對灘羊瘤胃細菌菌群結構與多樣性的影響，為進一步研究MOS對纖維物質的影響提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧組成

本試驗于2019年5—9月在寧夏農墾賀蘭山牛羊產業(集團)有限公司開展，試驗前1個月對羊舍做好清潔、防疫工作。

選取健康、體重在30.5 kg左右的寧夏斷奶灘羊羯羊20只，隨機分為4組，每組5只，獨籠飼養。基礎飼糧參照《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)并結合寧夏灘羊的飼養實踐進行配制，其組成及營養水平見表1。飼糧精粗比為30∶70，全株玉米青貯與蕎麥秸稈以60∶40混合作為粗飼料，其中蕎麥秸稈粉碎后與0.1%纖維素酶、1.0%麩皮混合均勻并密閉發酵30 d。對照組(CK-3組)灘羊飼喂基礎飼糧；試驗組灘羊飼喂在基礎飼糧基礎上分別添加1%(Y1-3組)、2%(Y2-3組)和3%(Y3-3組)MOS(純度>99%)的試驗飼糧，MOS與精料混合均勻，以保證全部MOS被羊只采食。試驗期為75 d，其中預試期15 d，正試期60 d。每天飼喂2次(07：30和17：30)，先喂粗料后喂精料，自由采食和飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 樣品采集

瘤胃液采集：在正試期第60天每組隨機選擇3只羊用瘤胃導管各采集瘤胃液50 mL，于-80 ℃超低溫保存，待測瘤胃發酵參數和菌群結構。

1.3 指標測定

1.3.1 瘤胃發酵參數

使用pHS-2型酸度計測定瘤胃液的pH，參照馮宗慈等[16]的方法測定氨態氮(NH3-N)含量；采用氣相色譜法測定揮發性脂肪酸含量。

1.3.2 16S rDNA測序

從樣本中提取基因組DNA后，用帶有barcode的特異引物擴增16S rDNA的V3+V4區，所用引物及引物序列為：341F，5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。然后PCR擴增產物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，以HiSeq 2500的PE250模式上機測序。測序得到raw reads之后，對低質量reads進行過濾，然后進行組裝和過濾，以保證利用最有效數據聚類成操作分類單元(OTUs)。

1.4 數據統計與分析

用Excel 2010對試驗數據進行簡單處理，并在SAS 8.2軟件上進行分析，數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 瘤胃發酵參數

由表2可知，在本試驗條件下，飼糧中添加不同水平的MOS對試驗羊的瘤胃液pH及NH3-N含量無顯著影響(P>0.05)，以Y2-3組數值最高。飼糧中添加不同水平的MOS顯著影響瘤胃液乙酸含量(P<0.05)，表現為Y1-3組、Y2-3組顯著高于Y3-3組(P<0.05)，其中以Y2-3組數值最高。各組間瘤胃液丙酸含量無顯著差異(P>0.05)。Y2-3組瘤胃液丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸含量以及乙酸/丙酸均高于其他組，但差異未達顯著水平(P>0.05)。

表2 瘤胃發酵參數

2.2 測序結果及其合理性

2.2.1 瘤胃菌群OTUs數量

測序共得888 992個有效序列，用Uparse軟件對所有樣本的全部有效序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，結果顯示12個樣本共產生4 104個OTUs。由圖1可知，CK-3組有979個OTUs，Y1-3組有943個OTUs，Y2-3組有1 184個OTUs，Y3-3組有998個OTUs。4組共享372個OTUs。Y1-3組OTUs相對CK-3組有所減少，而Y2-3組、Y3-3組OTUs相對CK-3組有所增加，說明不同添加水平的MOS對灘羊瘤胃菌群豐度的影響不同。

CK-3：CK-3組 CK-3 group；Y1-3：Y1-3組 Y1-3 group；Y2-3：Y2-3組 Y2-3 group；Y3-3：Y3-3組 Y3-3 group。下圖同 the same as below。

2.2.2 稀釋曲線

樣本稀釋曲線如圖2所示，隨著試驗測序深度的增加，各條曲線趨于平緩，表明測序深度覆蓋了樣本中的大部分微生物。樣本覆蓋度曲線如圖3所示，當測序深度達50 000 reads時，覆蓋度>0.99，已至飽和狀態，表明本試驗中測序飽和，測序量及測序深度合理，當前的測序量足夠進行菌群多樣性分析。

圖2 樣本稀釋曲線

圖3 樣本覆蓋度曲線

2.3 Alpha多樣性分析

如表3可知，Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的各Alpha多樣性指數與對照組均無顯著差異(P>0.05)，但是總體分析可知Y1-3組、Y2-3組、Y3-3組的菌群豐度較CK-3組提高，且多樣性增加，說明添加MOS可在一定程度上提高灘羊瘤胃菌群的多樣性。

2.4 Beta多樣性分析

2.4.1 樣本間物種組成聚類分析

根據各樣本豐度差異的統計結果，基于遺傳距離矩陣，采用非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)對樣本進行聚類分析。樣本越靠近，枝長越短，說明2個樣本的物種組成越相似。由圖4可知，與CK-3組樣本的瘤胃菌群構成相比差異由大到小依次為Y2-3組、Y1-3組、Y3-3組，說明飼糧中添加不同水平的MOS對灘羊瘤胃菌群組成有不同的影響，飼糧中添加2%MOS時灘羊瘤胃菌群組成與飼糧不添加MOS時差異最大。

CK-3-1、CK-3-2、CK-3-3為CK-3組的3個樣本，Y1-3-1、Y1-3-2、Y1-3-3為Y1-3組的3個樣本，Y2-3-1、Y2-3-2、Y2-3-3為Y2-3組的3個樣本，Y3-3-1、Y3-3-2、Y3-3-3為Y3-3組的3個樣本。

2.4.2 主坐標分析(PCoA)

通過PCoA，可以觀察到個體或者群體之間的差異。PCo1為第1主成分，表示分離樣品66.39%的方差；PCo2為第2主成分，表示分離樣品17.92%的方差。從圖5可知，與CK-3組相比，Y2-3組、Y3-3組的個體聚集度較高，而Y1-3組的個體聚集度降低，說明飼糧中添加2%或3%MOS均能使組內菌群組成相似性變得更高。Y2-3組的組內菌群組成相似性最高且與其他組間差異最大，說明飼糧中添加2%MOS對灘羊瘤胃菌群結構影響最大。

圖5 PCoA圖

2.5 系統分類學分析

2.5.1 MOS對灘羊瘤胃菌群在門水平上相對豐度的影響

將試驗得到的有效序列在不同分類水平上進行物種注釋及組間統計分析。如圖6所示，在門水平上共注釋得到12個菌門，相對豐度都在0.1%以上。變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為4組灘羊瘤胃菌群中的優勢菌門。其中，變形菌門是CK-3組、Y1-3組和Y3-3組這3組中共享的優勢菌門，而厚壁菌門、擬桿菌門是Y2-3組中的優勢菌門。Y2-3組較其他組極顯著提高了厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度(P<0.01)，極顯著降低了變形菌門的相對豐度(P<0.01)，且此組中浮霉菌門(Planctomycetes)、Kiritimatiellaeota、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)的相對豐度也較其他組高(表4)。上述結果說明飼糧中添加不同水平MOS對灘羊瘤胃菌群中的優勢菌門存在不同的影響，添加2%MOS提高了厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度，而降低了變形菌門的相對豐度。

表4 門水平相對豐度

圖6 門水平物種注釋

2.5.2 MOS對灘羊瘤胃菌群在屬水平上相對豐度的影響

為了進一步探索不同添加水平的MOS對灘羊瘤胃菌群結構影響的差異，對各組菌群進行了屬水平上的差異分析，總共得到56個菌屬，但是由于種類太多且相對豐度太小，僅對排名前20的菌屬進行分析，圖7為聚類熱圖，綠色越深代表細菌豐度越小，紅色越深代表細菌豐度越大。結合圖7和表5可知，CK-3組Rummeliibacillus、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)的相對豐度極顯著大于其他組(P<0.01)，不動桿菌屬(Acinetobacter)的相對豐度極顯著大于Y1-3組和Y2-3組(P<0.01)。Y1-3組叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃希氏菌屬-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)的相對豐度極顯著大于其他組(P<0.01)。Y2-3組賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1)、醋桿菌屬(Acetobacter)、理巖菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、乳球菌屬(Lactococcus)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、小梨形菌屬(Pirellula)的相對豐度極顯著大于CK-3組(P<0.01)。Y3-3組狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)的相對豐度極顯著大于其他組(P<0.01)。p-1088-a5_gut_group、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對豐度在4組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 屬水平相對豐度

續表5項目 Items組別 GroupsCK-3Y1-3Y2-3Y3-3P值P-value理巖菌科RC9腸道群 Rikenellaceae_RC9_gut_group1.62±0.06Bb1.38±0.26Bb3.52±0.56Aa1.63±0.15Bb<0.001克里斯滕森菌科R-7群Christensenellaceae_R-7_group2.14±0.18Bb0.80±0.11Cd2.77±0.36Aa1.23±0.08Cc0.001乳球菌屬 Lactococcus0.08±0.02Bc0.02±0.00Bc4.35±0.46Aa0.60±0.04Bb0.001腸球菌屬 Enterococcus1.63±0.36Aa0.64±0.05Bb0.80±0.12Bb0.88±0.04Bb<0.001解琥珀酸菌屬 Succiniclasticum0.43±0.07BC0.73±0.11Bbc1.67±0.32Aa0.77±0.09Bb<0.001瘤胃球菌科NK4A214群 Ruminococcaceae_NK4A214_group0.77±0.12ABb0.35±0.03Cc1.08±0.24Aa0.49±0.04BCc<0.001埃希氏菌屬-志賀菌屬Escherichia-Shigella0.85±0.16Bb1.46±0.23Aa0.05±0.03Cd0.33±0.01Cc0.001瘤胃球菌屬 Ruminococcus0.20±0.01Bc0.36±0.02Bbc0.97±0.22Aa0.45±0.02Bb<0.001鏈球菌屬 Streptococcus0.88±0.20Aa0.35±0.04Bb0.24±0.04Bb0.30±0.04Bb<0.001寡養單胞菌屬 Stenotrophomonas0.16±0.01Bb1.28±0.21Aa0.04±0.01Bb0.09±0.00Bb0.001p-1088-a5_gut_group0.37±0.120.11±0.030.85±0.850.16±0.130.218狹義梭菌屬1 Clostridium_sensu_stricto_10.12±0.04Bc0.24±0.03ABbc0.34±0.13Aab0.43±0.06Aa0.005鞘氨醇桿菌屬 Sphingobacterium0.00±0.00Bb0.98±0.55Aa0.00±0.00Bb0.00±0.00Bb0.006甲烷短桿菌屬 Methanobrevibacter0.14±0.050.12±0.060.16±0.030.51±0.730.543小梨形菌屬 Pirellula0.11±0.04Bb0.05±0.02Bb0.68±0.39Aa0.08±0.04Bb0.013

圖7 屬水平物種注釋

3 討 論

有研究表明瘤胃微生物可以利用飼糧中的寡糖，添加到飼糧中的寡糖在瘤胃中會被降解轉化為揮發性脂肪酸[17]。在MOS降解的過程中，對瘤胃發酵模式會產生影響而增加丙酸的產量。有研究者比較了基礎飼糧、基礎飼糧+乳寡糖、基礎飼糧+絲蘭植物提取液、基礎飼糧+乳酸鏈球菌肽4種飼糧對綿羊的影響，結果表明，各組干物質、有機物、粗蛋白質、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的消化率相似，寡糖組微生物氮的供給量最高，乙酸含量最低，丙酸含量最高[18]，說明瘤胃微生物可有效降解寡糖，但是由于瘤胃內環境的復雜性，目前尚不清楚這一系列變化的產生機理。

3.1 MOS對灘羊瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液pH可直觀反映瘤胃內環境是否正常，其過高或過低均不利于瘤胃微生物的生長、增殖[19]。本試驗中，4組灘羊瘤胃液pH變動范圍為6.45～6.86，在瘤胃液pH的正常范圍(5.5～7.5)內[20]。此外，本試驗條件下，不同添加水平的MOS對灘羊瘤胃液pH無顯著影響，這與張然等[21]的結果一致，即MOS添加水平在各時間點對體外瘤胃培養液pH沒有產生顯著影響，其分析原因可能是MOS添加水平(其最高添加水平為2%)太低。瘤胃液NH3-N含量可在一定程度上反映出瘤胃微生物分解含氮物質產生NH3-N及對其利用的情況。NH3-N含量過高，會增加瘤胃氮循環中氮素的損失，而NH3-N含量過低，則會限制纖維素分解菌分解纖維物質的效率[22]。本試驗中，4組灘羊瘤胃液NH3-N含量在13.33～14.85 mg/dL，在大多研究者認可范圍(10～50 mg/dL)之內[23]。本試驗中，不同添加水平的MOS對灘羊瘤胃液NH3-N含量無顯著影響，其中Y2-3組NH3-N含量最高。這可能是因為，添加2%MOS對纖維素分解菌分解纖維物質的效率的影響比其他組小，從而能保證纖維菌的正常生長增殖，也可能是2%MOS促進了分解含氮微生物的生長、增殖。瘤胃發酵類型及揮發性脂肪酸產量主要與飼糧的類型密切相關[24]，一般而言，粗飼料中纖維素、半纖維素、木質素的含量較高，瘤胃中發酵產生的乙酸比例較高。本試驗中，Y2-3組瘤胃液乙酸含量顯著高于Y3-3組、CK-3組且高于Y1-3組，在同等飼糧條件下，可能的原因是添加2%MOS促進了纖維分解菌的增殖，從而促進了纖維物質的降解。總體而言，添加不同水平MOS均可保證灘羊瘤胃內環境正常。

3.2 MOS對灘羊瘤胃菌群多樣性的影響

瘤胃微生物群落結構和多樣性長期以來一直是研究的熱點話題[25]。近幾年，16S rDNA高通量測序技術被用來研究反芻動物瘤胃微生物群落結構，更利于學者對瘤胃細菌遺傳多樣性的探究[26-27]。本研究基于16S rDNA高通量測序技術，探究添加不同水平MOS對灘羊瘤胃菌群多樣性的影響。通過質控測序共得888 992個有效序列用于后續多樣性組成分析。各組樣本稀釋曲線趨于平緩，表明測序深度覆蓋了樣本中的大部分微生物，且覆蓋度>0.99，說明測序量和測序深度合理。Alpha多樣性是對樣本中物種豐富度和多樣性進行分析，主要包括Chao1指數、Ace指數、Shannon指數和、Simpson指數，前2個指數可以反映樣品中群落的豐富數值，該值越大說明物種數量越多，即豐富度越高；后2個指數表示群落的多樣性，Shannon指數越大，Simpson指數越接近1，表明多樣性越高[28]。本試驗中4組灘羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數無顯著差異，但是總體來看，添加MOS組的瘤胃菌群多樣性較對照組有所增加，其中添加2%MOS組對瘤胃菌群多樣性影響最大，由Beta多樣性分析可知添加2%MOS組的瘤胃菌群構成與對照組相比差異最大。有研究者在錦江黃牛飼糧中添加功能性寡糖組合，結果表明可提升瘤胃液微生物種類[29]，與本試驗研究結果一致。有研究報道，MOS添加方式對哺乳期犢牛瘤胃菌群多樣性未產生顯著影響[30]。有研究表明，低聚糖可通過改變羔羊斷奶引起的腸道菌群變化及改變微生物的代謝等來影響動物的生產性能[31]。Newman等[32]在犢牛飼糧每天添加2 g MOS，5周后糞便中大腸桿菌數量明顯降低且呼吸道疾病減少，從而提高生產性能。趙曉靜等[33]在犢牛飼糧中分別添加0.1%和0.2%(干物質基礎)的MOS，結果顯示添加0.1%組在降低大腸桿菌和增加乳酸桿菌數量方面均較不添加組和添加0.2%組優勢明顯。任海軍[34]研究發現，飼糧中添加0.1%殼聚糖顯著增加了奶牛腸道乳酸桿菌數量且降低了大腸桿菌數量。以上結果均說明，添加一定水平的MOS可在一定程度上提高灘羊瘤胃菌群的多樣性。

3.3 MOS對灘羊瘤胃菌群結構的影響

有研究發現，擬桿菌門、厚壁菌門是反芻動物纖維物質降解的主要菌群，因此瘤胃中擬桿菌門、厚壁菌門豐度的高低與纖維物質降解緊密相關[35-36]。本試驗中，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為4組中的優勢菌門，與不添加MOS組菌群結構組成相比差異由大到小的添加水平依次為2%、1%、3%，其中添加2%MOS組厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度最高，說明添加2%MOS組灘羊的瘤胃內環境更利于瘤胃細菌對蕎麥秸稈等纖維物質的降解，在奶牛飼糧中添加MOS同樣發現能夠改善瘤胃中纖維素降解菌的豐度和活性[37-38]。另有研究表明變形菌門豐度的大量增加是胃腸道菌群失調的微生態標志[39]。本試驗中添加2%MOS組使變形菌門的相對豐度降低，說明在蕎麥秸稈飼糧條件下添加2%MOS可能有利于維持灘羊瘤胃菌群微生態平衡，具體機制還有待研究。浮霉菌門是嚴格厭氧的革蘭氏陰性細菌，有研究者為了研究浮霉菌門沿化學梯度的分布，對整個S?lenvannet湖的水柱進行了采樣，并使用16S rDNA擴增子測序和454焦磷酸測序對微生物群落進行了描述，結果表明與浮霉菌門相關的16S rDNA基因序列在湖泊的缺氧和氧化部分都存在，并且在整個水柱中分布不均，在15 m深的鹽堿地缺氧層中其相對豐度最高，為10%[40]。另外，有研究者在研究黃粉蟲降解腸道塑料廢物的能力時發現，其腸道浮霉菌門可以降解燕麥等纖維類飼料，但是在飼喂聚苯乙烯后浮霉菌門的攝食頻率增加[41]。黏膠球形菌門與纖維二糖的降解有關，郭威等[42]研究發酵玉米秸稈對綿羊瘤胃菌群結構的影響時發現，黏膠球形菌門和纖維桿菌門均為綿羊瘤胃中的優勢菌群。本試驗中，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中浮霉菌門、Kiritimatiellaeota和黏膠球形菌門的相對豐度較其他組高，說明添加2%MOS有利于增加與纖維分解有關的菌，從而促進蕎麥秸稈等纖維物質的降解。

在屬水平上，本試驗中的4組灘羊瘤胃中不同菌群的相對豐度差異明顯。相比其他組，添加2%MOS對灘羊瘤胃菌群結構及其相對豐度影響最大，其中賴氨酸芽孢桿菌屬、普雷沃氏菌屬1、醋桿菌屬為優勢菌屬且其相對豐度極顯著大于其他組。普雷沃氏菌屬具有多種功能，它不僅能促進最初的蛋白質分解并協同其他分解纖維素菌發揮作用，提高機體對纖維素的分解能力[43]，且對植物中非纖維性多糖和蛋白質的降解也有一定的作用[44]。本試驗結果說明添加2%MOS可促進灘羊瘤胃中普雷沃氏菌的增殖，從而增強對蕎麥秸稈等相關纖維物質的降解能力。另外，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中理巖菌科RC9腸道群、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬的相對豐度也極顯著大于其他組。普雷沃氏菌屬1和理巖菌科RC9腸道群都屬于擬桿菌門[45]，所以可推測理巖菌科RC9腸道群可能是與非纖維植物成分降解有關的細菌。瘤胃球菌屬和琥珀酸菌屬均有降解纖維物質的能力[46-47]。瘤胃球菌科NK4A214群屬于瘤胃球菌科，有研究表明瘤胃球菌科是一類典型的纖維降解菌[48]，飼糧中性洗滌纖維的消化率隨著瘤胃球菌科豐度的增加而增加[49-50]。也有研究表明瘤胃球菌科可促進宿主對飼糧中氮的消化和利用[51-52]。另外，本試驗結果顯示，添加2%MOS組灘羊瘤胃菌群中克里斯滕森菌科R-7群、乳球菌屬、小梨形菌屬的相對豐度也極顯著大于其他組，這些微生物可能在灘羊瘤胃體內扮演著重要的生理及生態角色。

4 結 論

① 本試驗條件下，飼糧中添加不同水平MOS均可保證灘羊瘤胃內環境正常。

② 本試驗條件下，飼糧中添加MOS可增加灘羊瘤胃菌群的多樣性，其中2%MOS對其影響最大。

③ 本試驗條件下，飼糧中添加2%MOS對灘羊瘤胃菌群結構影響最大，可提高纖維素降解菌的相對豐度，有利于增強灘羊對飼糧纖維物質的降解能力。