高、低淀粉飼糧對山羊小腸甜味受體信號通路基因表達的影響

燕愛飛 周芳芳 康勁翮 王 榮 王 敏 林 波 冉 濤 劉 勇* 譚支良

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，長沙 2410125；2.中國科學院大學現代農業科學學院，北京 2100049；3.廣西大學動物科學技術學院，南寧 2530004)

近年來，高谷物飼糧已成為提升反芻動物養殖經濟效益的一種營養策略。淀粉(starch)作為高谷物飼糧的重要能源物質，充分研究其在反芻動物胃腸道中感應、轉運和吸收等生理過程，對于指導畜牧生產、通過營養調控手段實現養殖業提質增效具有重要意義。

飼糧中約80%淀粉被瘤胃微生物降解成揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，經瘤胃上皮吸收，為機體提供能量。高谷物飼糧中5%～20%淀粉到達小腸，并經胰α淀粉酶作用生成寡糖、低聚糖、二糖或單糖[1]，然后在位于腸上皮內的感應受體和轉運載體的作用下被吸收利用。腸道內的營養物質感應受體主要是G-蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)[2-3]，如感應糖類物質的甜味受體Ⅰ型味覺受體2/Ⅰ型味覺受體3(taste receptor type 1 member 2/taste receptor type 1 member3， T1R2/T1R3)。甜味受體T1R2/T1R3是由第一味覺受體家族(taste receptor family 1， T1Rs)中T1R2和T1R3構成的異二聚體，是人類及部分哺乳動物口腔及胃腸道內的主要甜味物質感應受體[4-6]。T1R2/T1R3感知腸腔中葡萄糖[4，7]，激活級聯信號轉導通路，促使腸道味覺化學感應細胞(taste-chemosensory cells，TCS)活化，一方面將甜味信號分子以及腸腔內葡萄糖信號傳導給神經系統，另外一方面激活鈉/葡萄糖共轉運載體1(sodium-glucose linked transporter 1，SGLT1)和葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporters 2，GLUT2)實現單糖的轉運。單糖或人工甜味劑與其關鍵位點結合，活化α-味移導素(α-gustducin)，并產生活性的G蛋白α亞基和游離β、γ亞基[8]。α亞基通過環磷酸腺苷(cAMP)途徑引起胞外Ca2+內流，使TCS去極化；β、γ亞基激活磷脂酶 C-β2(phospholipaseC-β2， PLC-β2)使其發生異構化，分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，使內質網儲存的大量Ca2+釋放到細胞質中，引起瞬態受體電位陽離子通道的開放，促進Na+內流而使TCS去極化[9-13]。T1R2/T1R3介導信號通路能促進腸道激素如胃泌素抑制肽(gastrin inhibitory peptide，GIP)、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)的分泌[14]，并促進SGLT1的表達[15]。有研究證實甜味受體T1R2/T1R3與SGLT1和GLUT2的表達呈顯著正相關[16]。在實際生產中，給反芻動物飼喂高淀粉飼糧無疑會使過瘤胃淀粉比率增加，因而使得小腸單糖濃度升高，猜測這一系列變化將活化腸道甜味化學感應細胞，激活T1R2/T1R3信號轉導通路，并對在葡萄糖感知、吸收轉運以及腸道激素分泌等方面發揮重要作用。對甜味受體的研究可以為提高淀粉在小腸內的消化利用率提供新的思路。因此，本研究旨在探明成年黑山羊采食高、低淀粉飼糧對甜味受體T1R2/T1R3及其信號通路元件基因表達以及腸道激素濃度的影響，為反芻動物飼糧配制及營養調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選用20只體況良好、體重[(17.50±2.67) kg]相近的(10.0±0.5)月齡雄性湘東黑山羊作為試驗動物，隨機分為2組(每組10只)，分別飼喂以玉米粉和玉米皮為主要能量飼料的高淀粉飼糧(50.4%，HS組)和低淀粉飼糧(13.1%，LS組)。飼糧配方參照NRC(2012)標準配制，精粗比為75∶25，飼糧組成及營養水平見表1。試驗動物單籠飼養，每天08：00和18：00各飼喂1次，自由飲水，預試期10 d，正試期38 d。試驗期間，每天記錄飼喂量和余料量，計算日采食量(剩料<5%)，試驗最后1周全收集糞、尿，用于計算營養物質表觀消化率。本試驗所涉及動物飼養管理與屠宰流程符合中國科學院亞熱帶農業生態研究所動物實驗倫理委員會的動物倫理要求。

表1 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 營養成分測定

精料、粗料和糞樣中常規營養成分含量均參照AOAC(1990)[17]方法進行測定。干物質含量采用烘干法(GB/T 6435—2014)測定；能量(GE)采用氧彈式量熱計方法(ISO/9831—1998)，利用等溫式全自動量熱儀(Cskaide， 5E-AC8018)測定；粗蛋白質(CP)含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)測定；中性洗滌纖維(NDF，GB/T 20806—2006)和酸性洗滌纖維(ADF，NY/T 1459—2007)含量采用范氏洗滌纖維法，利用自動纖維分析儀(Gerhardt， Fibretherm FT 12)測定；粗灰分(Ash)以及有機物(OM)含量采用灼燒法(GB/T 6438—1992)測定；纖維素含量參照李華等[18]的方法測定；粗脂肪(CF)含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006)，利用全自動脂肪測定儀(Gerhardt， SOX 402 Micro/SOX 416 Macro)測定；淀粉含量參照GB/T 5009.159—2003的酶水解法測定。為保證數據的可靠性，每個樣品單個營養成分含量測定均設定2個平行。營養物質表觀消化率計算公式如下：

營養物質表觀消化率(%)=[(營養物質
攝入量-糞中營養物質排出量)/營養物質攝入量]×100。

1.3 樣品采集

飼養試驗結束，試驗羊稱重、屠宰和采集樣品。分別取十二指腸中段、空腸前端(0.5 m)和回腸末端(2～3 cm)處的組織樣品，生理鹽水沖洗3～5次，4%多聚甲醛組織固定液固定12～24 h，蘇木精-伊紅(HE)染色法用于形態學觀察；各腸道相同位置取5～10 cm組織樣品，生理鹽水沖洗3～5次，液氮凍存，轉移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。收集十二指腸、空腸和回腸內容物20 g，液氮凍存，轉移至-80 ℃冰箱保存，用于測定腸道內容物激素及葡萄糖濃度。

1.4 腸道黏膜形態學檢測

參考Lesmeister等[19]的組織切片法，將腸道固定樣品經洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、染色和封片等處理，用正置熒光顯微鏡(Olympus， BX51)觀察腸道黏膜形態結構。用圖像采集處理軟件(DP2-BSW)測量小腸絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度，每個切片讀取6次數值。

1.5 腸道內容物激素濃度測定

參照酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書(凡科維)，用酶標儀(Raytort-6100)測定腸道內容物和腸道黏膜中的GLP-1、GLP-2、膽囊收縮素(CCK)、GIP和酪酪肽(Pyy)的濃度[20]。

1.6 腸道甜味受體基因表達量測定

將-80 ℃組織樣品解凍，用Trizol(Invitrogen，美國)試劑盒參照產品說明從樣品中提取總RNA[21]。用DNase I (Thermo Scientific，美國)清除DNA分子，使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific，美國)測定RNA質量和濃度，并用凝膠電泳檢測所提取的RNA的完整性。隨后立即用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa，日本)對符合質量要求的RNA逆轉錄為cDNA。將制備的cDNA樣品進一步純化、定量并稀釋至相同初始濃度，-20 ℃保存。根據GenBank中發表的山羊基因序列設計，使用Primer premier 6.0軟件進行目的基因和內參基因[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)]的引物設計，并用Primer BLAST工具在線進行引物特異性分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及參數見表2。

表2 引物序列及參數

1.7 數據統計

試驗數據先經Excel 2016進行匯總，再使用SPSS 24進行數據統計分析，用one-way ANOVA程序進行方差分析，試驗結果均以平均值(mean)及均值標準誤(SEM)表示，設定P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.15為有變化趨勢。

2 結 果

2.1 高、低淀粉飼糧對山羊營養物質攝入量和營養物質表觀消化率的影響

由表3可知，在營養物質攝入量方面，雖然2組山羊DM、OM和GE攝入量無顯著差異(P>0.05)，但是HS組山羊攝入的CP、NDF和ADF均較LS組顯著降低(P<0.05)，而淀粉的攝入量顯著提高(P<0.05)；在表觀消化率方面，與LS組比，HS組中淀粉、DM和OM的表觀消化率均顯著提高(P<0.05)，但NDF、ADF和CP的表觀消化率均顯著下降(P<0.05)。

表3 高、低淀粉飼糧對山羊營養物質攝入量和表觀消化率的影響

2.2 高、低淀粉飼糧對山羊小腸黏膜結構的影響

由表4可知，HS組十二指腸絨毛高度(P=0.072)和隱窩深度(P=0.084)低于LS組，但絨毛高度/隱窩深度(V/C)在2組間沒有顯著差異(P>0.05)；空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度及V/C均無顯著差異(P>0.05)。

表4 高、低淀粉飼糧對山羊小腸腸道黏膜結構的影響

由圖1可知，各營養物質表觀消化率對十二指腸和空腸黏膜結構的影響程度大于回腸，且淀粉表觀消化率與空腸的絨毛高度(r=-0.27，P<0.01)和隱窩深度(r=-0.29，P=0.02)呈顯著負相關，而空腸絨毛高度和隱窩深度與CP、ADF和NDF表觀消化率呈顯著正相關性，絨毛高度與CP、ADF和NDF表觀消化率正相關系數分別為0.34、0.28和0.27(P<0.01、P<0.01和P<0.01)，隱窩深度與CP、ADF和NDF表觀消化率的相關系數分別為0.30、0.25和0.22(P<0.05、P=0.22和P=0.36)。

NDF_AD：中性洗滌纖維表觀消化率；ADF_AD：酸性洗滌纖維表觀消化率；CP_AD：粗蛋白質表觀消化率；Starch_AD：淀粉表觀消化率；DMI：干物質采食量 dry matter intake；VH_duodenum：十二指腸的絨毛高度；CD_duodenum：十二指腸的隱窩深度；V/C_duodenum：十二指腸的絨毛高度/隱窩深度；VH_Jejunum：空腸的絨毛高度；CD_Jejunum：空腸的隱窩深度；V/C_Jejunum：空腸的絨毛高度/隱窩深度；VH_ileum：回腸的絨毛高度；CD_ileum：回腸的隱窩深度；V/C_ileum：回腸的絨毛高度/隱窩深度；JGlucose-conc：空腸內容物葡萄糖濃度；IGlucose-conc：回腸內容物葡萄糖濃度。下圖同 the same as below。

2.3 高、低淀粉飼糧對山羊回腸黏膜和內容物中激素濃度的影響

由表5可知，回腸黏膜中CKK、GLP-1、GLP-2、Pyy和GIP濃度在2組間無顯著差異(P>0.05)；HS組回腸內容物GLP-1濃度顯著高于LS組(P<0.05)，但2組間Pyy、GIP、CCK和GLP-2濃度無顯著差異(P>0.05)。

表5 高、低淀粉飼糧對山羊回腸黏膜和內容物中激素濃度的影響

由圖2可知，回腸黏膜中各激素濃度的相關性強且具有協同效應(聚類分析)，其中Pyy濃度與GLP-2、GLP-1濃度的相關系數分別為0.82(P<0.01)和0.73(P<0.01)，而GLP-1與GLP-2濃度間的相關系數為0.60(P<0.01)。從營養學角度分析，回腸黏膜中CCK(r=0.27，P<0.01)、GLP-2(r=0.20，P=0.08)和Pyy(r=0.22，P<0.05)濃度與淀粉攝入量呈正相關，而GLP-1(r=-0.01，P=0.49)和GIP(r=-0.11，P=0.14)濃度則與淀粉攝入量呈負相關性；同時，表中腸道激素濃度與CP、NDF和ADF攝入量的相關性與淀粉攝入量的相關性相反(圖2)。

ADF_intake：酸性洗滌纖維攝入量；NDF_intake：中性洗滌纖維攝入量；CP_intake：粗蛋白質攝入量；Starch_intake：淀粉攝入量；GIP：胃泌素抑制肽 gastric inhibitory polypeptide；GLP-1：胰高血糖素樣肽-1 glucagon-like peptide-1；GLP-2：胰高血糖素樣肽-2 glucagon-like peptide-2；CCK：膽囊收縮素 cholecystokinin；Pyy：酪酪肽 peptide tyrosine-tyrosine。下圖同 the same as below。

2.4 高、低淀粉飼糧對山羊甜味受體以及關鍵通路元件基因表達量的影響

由表6可知，除HS組空腸中α-gustducin的基因表達量顯著低于LS組(P<0.05)之外，其余甜味受體通路元件包括T1R3、α-gustducin、TRPM5、GLUT2和SGLT1基因在十二指腸、空腸和回腸的表達量在2組間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 高、低淀粉飼糧對山羊甜味受體以及通路關鍵元件基因表達量的影響

由圖3可知，空腸中T1R3、TRPM5、SGLT1和GLUT2基因表達量與淀粉攝入量存在一定的正相關性，空腸α-gustducin基因表達量與淀粉表觀消化率間則存在一定的負相關(r=-0.21，P=0.08)。與淀粉表觀消化率相比，空腸T1R3、TRPM5基因表達量與CP、ADF和NDF表觀消化率的相關系數更低(r<0.05，P>0.05)，而GLUT2和SGLT1基因表達量與CP、ADF和NDF表觀消化率間則呈負相關(-0.100.05)。回腸T1R3(r=-0.10，P<0.01)和α-gustducin(r=-0.34，P<0.01)的基因表達量與淀粉表觀消化率呈顯著負相關，回腸T1R3基因表達量與CP、ADF和NDF的表觀消化率呈顯著正相關(0.02

NDF_AD：酸性洗滌纖維表觀消化率；ADF_AD：中性洗滌纖維表觀消化率；CP_AD：粗蛋白質表觀消化率；Starch_AD：淀粉表觀消化率；GLUT2：葡萄糖轉運蛋白2 glucose transporters 2；TRPM5：瞬時受體電位離子通道蛋白M型5 transient receptor potential cation channel subfamily M member 5；T1R3：Ⅰ型味覺受體3 taste receptor type 1 member 3；SGLT1：鈉/葡萄糖共轉運載體1 sodium-glucose linked transporter 1；α-gustducin：α-味移導素。下圖同 the same as below。

2.5 高、低淀粉飼糧對山羊小腸內容物葡萄糖濃度的影響

由表7可知，HS組空腸和回腸內容物中葡萄糖濃度均顯著高于LS組(P<0.05)。

表7 高、低淀粉飼糧對山羊小腸內容物葡萄糖濃度的影響

2.6 回腸甜味受體通路元件與回腸黏膜激素濃度和葡萄糖濃度的關聯分析

由圖4可知，回腸T1R3基因表達量與回腸黏膜中CCK濃度的相關系數為-0.36(P<0.01)。回腸內容物葡萄糖濃度跟腸道黏膜GLP-1濃度的相關系數為0.48(P<0.01)，與GIP濃度的相關系數為0.45(P<0.01)，與Pyy濃度的相關系數為0.45(P<0.01)。回腸SGLT1和α-gustducin基因表達量與腸道內容物葡萄糖濃度的相關系數分別為0.28(P<0.05)和0.26(P<0.05)。

Crypt_depth：隱窩深度；Villus_height：絨毛高度；V/C：絨毛高度/隱窩深度 villus height/crypt depth。

3 討 論

反芻動物對甜味和鮮味存在一定偏好，研究發現飼糧中水溶性碳水化合物含量升高可促進動物采食。淀粉在反芻動物小腸內消化的終產物為葡萄糖，而甜味受體T1R2/T1R3通過其介導的信號轉導通路實現對葡萄糖的感應，但是攝入高淀粉飼糧對甜味受體T1R2/T1R3介導的信號通路(α-gustducin、TRPM5)以及葡萄糖轉運載體(SGLT1、GLUT2)基因表達的影響尚未見報道。

小腸黏膜結構易受飼糧結構的影響，研究證實各類營養物質如蛋白質、淀粉或脂肪，能促進小腸發育[22-24]。?itan等[25]報道稱，高精料飼糧可影響十二指腸、空腸的腸絨毛高度以及十二指腸隱窩深度，但王艷紅[26]指出飼糧淀粉水平并不影響除空腸絨毛高度以外的小腸形態。本試驗中，高淀粉飼糧使山羊十二指腸和空腸絨毛高度分別下降了23.92%和18.38%，使十二指腸隱窩深度下降了22.73%。而高淀粉飼糧對回腸黏膜結構無顯著影響，這與王艷紅[26]報道一致。本研究中，飼糧淀粉表觀消化率與腸道黏膜結構間呈弱相關性，可能是本試驗中采用10月齡的育肥山羊為試驗動物，其腸道發育趨于成熟，受飼糧的影響較小，這可能與瘤胃微生物降解淀粉生成的揮發性脂肪酸有關(揮發性脂肪酸能改善腸道屏障功能，保護上皮完整性)[27-28]。

甜味受體T1R2/T1R3具有腸道甜味感受及調節葡萄糖動態平衡的作用，腸腔內甜味物質被腸上皮細胞頂端的甜味受體感知，促使腸道激素的釋放。本試驗中HS組回腸黏膜和腸道內容物中的GLP-1和GLP-2濃度都略高于LS組，但二者間無顯著差異。其原因可能是GLP-1分泌后被快速水解或與受體(GLP-1R)結合而發生自身磷酸化反應，導致了腸黏膜組織內GLP-1濃度差異不顯著。GLP-1、GLP-2等腸道激素的分泌受腸腔內單糖濃度的影響，腸道激素濃度跟淀粉攝入量呈正相關性(與CP、ADF和NDF攝入量呈負相關性)，但相關系數不高，這也在一定程度說明了淀粉攝入量是影響腸道激素濃度的重要因素。另外，因屠宰時需要采取饑餓處理，故本試驗中測定的腸道激素濃度僅代表在低營養狀態下的特征值，這有可能是本研究腸道激素濃度差異不顯著以及相關性系數不高的一個原因。

山羊腸道中廣泛表達甜味受體T1R2/T1R3，但隨著日齡的增長而表達量下降[16]，而且隨著瘤胃功能逐漸發育完善，瘤胃微生物對淀粉起主導消化作用。此外，飼糧能量水平也會影響T1R2/T1R3基因表達。高糖攝入增加血糖濃度，使甜味受體介導的GLP-1等降血糖素的分泌增加，引起T1R2/T1R3基因的表達量降低[29]。本研究中甜味受體和通路元件的基因表達量之間呈上調或下調的協同變化趨勢，免疫熒光共定位試驗證明甜味受體蛋白及下游信號蛋白α-gustducin、TRPM5之間存在共表達關系[30]。綜合分析，回腸和空腸各特征值間的相關性結果顯示，淀粉是甜味信號通路相關元件和葡萄糖轉運載體基因表達的主要影響因素。在腸道中，甜味受體、腸道激素、葡萄糖轉運載體及腸道內葡萄糖濃度間組成一個動態穩衡網絡，本試驗中HS組甜味受體介導信號通路元件的基因表達量無顯著變化，原因可能是機體為了維持糖代謝，通過降低關鍵元件的基因表達而減少糖的攝入，但這個猜測需進一步驗證。

山羊十二指腸和空腸是甜味受體表達的主要部位[17]。本試驗中空腸甜味受體T1R2/T1R3通路元件基因表達量高于回腸和十二指腸，空腸內容物葡萄糖的濃度也高于回腸，說明空腸可能是糖類消化吸收的主要場所。腸中單糖、寡糖或其類似物均可直接調控腸黏膜中SGLT1的基因表達[31]，但本試驗中不同水平淀粉飼糧對腸道中SGLT1、GLUT2的基因表達量無顯著影響，但空腸中SGLT1、GLUT2基因表達量與空腸內容物中葡萄糖濃度呈正相關。而回腸中則表現出相反的結果，可能是空腸作為短鏈碳水化合物消化吸收的主要場所，導致進入回腸內葡萄糖濃度低。本試驗結果顯示，T1R3、SGLT1和GLUT2在腸道內的基因表達具有協同關系，甜味受體的基因表達量與SGLT1、GLUT2基因表達量之間呈正相關[16]。針對幼齡羔羊，因瘤胃功能尚未發育成熟，進入小腸的葡萄糖濃度增加，直接刺激羔羊腸腔中葡萄糖轉運載體基因mRNA的表達，進而增加羔羊小腸葡萄糖轉運載體SGLT-1和GLUT-2的表達量[32]，而成年綿羊腸腔葡萄糖濃度低，腸道上皮細胞絨毛頂端的SGLT1的表達量就相對較低，但經30 mmol/L的葡萄糖(≈5 g/L)灌注后，SGLT1表達量在短時間內即可恢復并使葡萄糖轉運能力提高[33]，與本試驗HS組回腸以及空腸SGLT1基因表達量上調相一致。本試驗腸道內容物葡萄糖濃度(0.13 g/L)可能是因為采樣時間點無法與腸道消化時間點吻合，所測定的腸道內容物葡萄糖濃度低。十二指腸中SGLT1、GLUT2基因表達量無顯著差異可能是因為流通速度過快，也可能是因為采樣時間點無法與胃排空時間點吻合。文獻報道稱，T1R2/T1R3表達量與SGLT1和GLUT2的表達量是顯著相關[16]，這與本研究中腸道基因表達量的結果是基本一致的。高淀粉飼糧對甜味受體表達的影響可能是進入腸腔內的葡萄糖被甜味受體感應，通過甜味受體的信號傳導通路來活化細胞，促使腸道激素的分泌，提高SGLT1基因表達[7]，這也是為何前期研究中顯示在飼糧中添加人工甜味劑能提高SGLT1的表達[7]。另外，甜味受體作為葡萄糖的感受器而調控葡萄糖平衡，高葡萄糖濃度逆向下調甜味受體基因表達，機體可能通過感受腸腔的葡萄糖濃度來上調或下調甜味受體基因表達，調控腸道激素如GLP-1、GLP-2和GIP等的分泌，進而影響SGLT1和GLUT2的表達[6]。

4 結 論

本試驗條件下，高淀粉飼糧對成年山羊腸道甜味受體T1R2/T1R3及其關鍵通路元件TRPM5、葡萄糖轉運載體(SGLT1、GLUT2)的基因表達量以及回腸激素濃度均無顯著影響，但顯著降低空腸α-gustducin基因表達量；關聯性分析顯示，飼糧淀粉攝入量與腸道甜味受體、相關通路元件以及轉運載體基因表達量呈正相關，而CP、ADF和DNF攝入量與其呈負相關。綜上所述，淀粉是甜味信號通路元件以及葡萄糖轉運載體的主要影響因素，但高淀粉飼糧對發育成熟的山羊腸道黏膜結構及功能影響較小。