表達豬表皮生長因子重組乳酸乳球菌的構建及其對結腸炎模型小鼠腸道損傷的修復作用

劉淑杰 陶 新 鄧 波 門小明 徐子偉

(浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，杭州 2310021)

仔豬早期斷奶技術是現代規模化豬場普遍采用的關鍵技術，其重要性日益顯著。然而早期斷奶卻是仔豬必須經歷的一個重大創傷性事件，首當其沖是損害腸道健康。斷奶應激極易造成仔豬腸道損傷，黏膜形態改變，消化酶活性降低，功能基因與蛋白表達異常，最終導致整個消化系統功能紊亂，嚴重阻礙了仔豬健康生長，給畜牧業造成嚴重的經濟損失[1-3]。腸道健康是決定仔豬整體健康和后期生產力水平的關鍵因素，對腸道進行損傷修復一直是仔豬營養研究的重點。

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是一個含有53個氨基酸的單鏈多肽，分子質量為6.05 ku，屬于促生長因子家族成員之一[4]。EGF是一種強有力的細胞有絲分裂原，可刺激細胞分裂、增殖，增加上皮組織的DNA與蛋白質合成，其獨特作用是促進胃腸組織生長和發育[5]。研究顯示，EGF可以刺激胃腸道上皮細胞增殖與分化，促進腸道生長發育，誘導小腸黏膜刷狀緣消化酶表達，改善機體對養分的消化利用[6]。母乳是動物哺乳時期腸道EGF的主要來源，早期斷奶使仔豬突然中斷乳源性豬表皮生長因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)，此時通過外源補充pEGF極有可能是修復斷奶仔豬腸道損傷、維護正常腸道功能屏障的一個有效途徑。然而，關于pEGF對斷奶仔豬腸道作用方面的報道還比較缺乏，有限的來源、昂貴的價格是制約其在畜牧業領域研究及應用的主要原因。

基因工程是獲得pEGF來源的好方法。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)是乳酸菌的一個典型模式菌株，存在于人和動物的腸道中并發揮重要的生理功能，是公認的安全級微生物(generally recognized as safe，GRAS)[7]。L.lactis具有不產生內毒素、生長迅速和易于操作等優點，成為表達外源蛋白的理想候選者；另外，L.lactis表達的外源蛋白可保持天然構型，不需要進一步純化可直接連同菌體一起服用[8]。目前，采用L.lactis載體系統已經表達出了多種外源抗原(出血性敗血癥病毒G蛋白、Ⅲ型鴨乙型肝炎病毒VP1蛋白)[9-10]、酶類(β-1，4-葡聚糖內切酶egl3、L-乳酸脫氫酶)[11-12]和活性肽(胰島素樣生長因子-Ⅰ、牛乳鐵蛋白肽)[13-14]等，并應用于食品工業、生物制藥和疫苗等研究領域。pEGF的來源有限制約了其在斷奶仔豬上的研究及應用，L.lactis表達系統已經發展成熟，鑒于此，本研究采用L.lactis高效誘導表達系統，構建表達pEGF的重組L.lactis，以葡聚糖硫酸鈉(dextra sulfate sodium，DSS)誘導的結腸炎小鼠為模型動物，研究重組pEGF對腸道形態結構、通透性和細胞因子濃度的影響，評價其對損傷腸道的修復作用，為將表達pEGF重組L.lactis應用于斷奶仔豬腸道保護提供重要的依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

乳酸鏈球菌素(Nisin)誘導型細胞內表達載體pNZ8148和宿主菌L.lactisNZ9000購自荷蘭NIZO研究所。

1.2 主要試劑

Nisin購自美國Sigma公司，限制性內切酶NcoⅠ、HindⅢ和T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，兔抗EGF單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司，DSS(相對分子質量為36 00～50 000)購自上海MP公司，10%中性甲醛購自杭州長青化工有限公司。

1.3 pEGF基因設計與優化

pEGF是一個由53個氨基酸組成的分子質量為6.05 ku的小分子蛋白質，為了增加表達量，根據GenBank中登錄的pEGF基因序列，設計將3個拷貝數的pEGF基因同向串聯，相鄰pEGF序列之間通過柔性Linker(氨基酸序列為GGGGSG)連接。然后，基于L.lactis對密碼子的偏好性進一步優化該序列，并在基因序列全長的5′端加入限制性內切酶NcoⅠ，3′端加入終止密碼子(TAA)和限制性內切酶HindⅢ。總基因序列長度542 bp，重組蛋分子質量約19 ku。將設計好的基因序列送至上海生物工程有限公司合成。

1.4 重組L. lactis的構建

將表達載體pNZ8148用限制性內切酶NcoⅠ、HindⅢ雙酶切，純化回收雙酶切載體片段。將合成好的3pEGF基因與表達載體連接，電轉化至感受態L.lactisNZ9000中，利用氯霉素(10 mg/mL)對轉化子進行篩選，挑取白色菌落，培養重組菌，然后提取重組質粒，將重組質粒進行雙酶切鑒定與DNA序列測定(由上海英俊生物技術有限公司完成)。鑒定正確的質粒命名為pNZ8148-3pEGF，重組菌命名為L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)。

1.5 重組pEGF的表達及Western blot檢測

將重組菌L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)接種于GM17液體培養基中，37 ℃厭氧培養至光密度(OD)=0.4～0.5，加入終濃度為5 μg/L的誘導劑Nisin，繼續培養3 h；將培養物離心后收集菌體，向菌體中加入等體積的1倍上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心，上清液經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉印至硝酸纖維素膜上，以羊抗EGF單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔為二抗，對目的蛋白進行分析。

1.6 表達pEGF重組L. lactis對小鼠腸道損傷修復作用的研究

將32只8周齡雌性BALB/c小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體重為18～24 g)隨機分為4組，每組8只。采用4%的DSS建立小鼠結腸炎模型，各組小鼠具體處理如下：正常對照組，試驗第1～12天飲用自來水；DSS模型對照組，試驗第1～7天飲用4%的DSS水溶液，第8～12天飲用自來水；L.lactis組，飲水按照DSS模型對照組處理，同時每天08：00口服(灌胃)1×1012CFUL.lactisNZ9000 (pNZ8148)，連續口服12 d；重組L.lactis組，飲水按照DSS模型對照組處理，同時每天08：00口服(灌胃)1×1012CFU重組L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)，連續口服12 d。飼養環境溫度為(24±1) ℃、相對濕度40%～70%，光照周期12 h明、12 h暗。

1.7 小鼠樣本采集及處理

試驗第13天，于小鼠眶下靜脈采血，分離血清；頸椎脫臼法處死小鼠，沿腹中線打開腹腔，取出腸道組織，測定小鼠盲腸端至肛門的結腸長度；截取1 cm結腸組織放入10%中性甲醛溶液中，樣品經石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色，顯微鏡下觀察小鼠結腸形態結構，用于組織病理學分析。剩余的結腸放于-70 ℃冰箱保存待測其他指標。

1.8 結腸通透性相關指標及細胞因子濃度的測定

準確稱取小鼠結腸重量，加入滅菌生理鹽水，機械勻漿后離心取上清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定結腸閉鎖蛋白(occludin)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度，采用比色法測定小鼠血清二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性和D-乳酸(D-lactate，D-LAC)濃度。

1.9 統計分析

試驗數據采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan氏法多重比較，試驗數據以“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01則為差異極顯著。

2 結 果

2.1 表達pEGF重組L. lactis的構建

表達載體pNZ8148經限制性內切酶NcoⅠ、HindⅢ雙酶切后，與合成的3pEGF基因片段連接并轉化至L.lactisNZ9000中，重組質粒經NcoⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，目的基因大小相符(圖1)，證明外源基因3pEGF插入表達載體中。測序結果表明目的片段序列正確，3pEGF基因插入位置和方向與預期結果完全一致。

M：DNA分子量標準 DNA marker；1、2：NcoⅠ、HindⅢ雙酶切 NcoⅠ and HindⅢ double digestion；3pEGF：3個拷貝數的豬表皮生長因子 3 copies of porcine epidermal growth factor。

2.2 pEGF的表達及Western blot分析

L.lactisNZ9000 (pNZ8148-3pEGF)經Nisin誘導表達后，菌體裂解液經SDS-PAGE后轉印至硝酸纖維素膜上，采用Western blot方法檢測重組蛋白，與L.lactisNZ9000 (pNZ8148)相比，膜上重組菌的位置出現特異性條帶(圖2)，說明L.lactis能夠表達pEGF，且能與EGF單克隆抗體結合，初步證明重組pEGF具有生物活性。

1、3：L. lactis NZ9000 (pNZ8148-3pEGF)菌體蛋白 bacterial protein of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-3pEGF)；2、4：L. lactis NZ9000 (pNZ8148)菌體蛋白 bacterial protein of L. lactis NZ9000 (pNZ8148)。

2.3 試驗小鼠臨床表現

正常對照組小鼠采食、飲水、活動及精神狀態均正常，皮毛順滑有光澤，無便血。DSS模型對照組小鼠飲用4% DSS水溶液后，采食和飲水逐漸減少，活動遲緩，精神萎靡，皮毛蓬松無光澤，試驗第6天全部出現直腸便血或水樣稀便。L.lactis組小鼠采食和飲水也相應減少，皮毛蓬松，試驗第6天直腸出現血便，個別出現稀便。重組L.lactis組小鼠皮毛順滑，活動和精神狀況較為正常，個別小鼠出現稀便。

2.4 試驗小鼠結腸長度及形態

與正常對照組相比，DSS模型對照組小鼠結腸長度顯著降低(P<0.05)，降低了34.77%(圖3)。與DSS模型對照組和L.lactis組相比，重組L.lactis組小鼠結腸長度顯著增加(P<0.05)，分別增加了34.32%和19.72%，并與正常對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖3)。DSS模型對照組和L.lactis組間小鼠結腸長度差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明口服表達pEGF的重組L.lactis抑制了小鼠結腸的縮短。

數據柱形標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

HE染色結果(圖4)顯示，正常對照組小鼠結腸結構清晰，黏膜層上皮細胞完整，未見脫落，未見炎癥細胞浸潤和潰瘍等；DSS模型對照組小鼠結腸黏膜上皮細胞大量脫落，可見潰瘍形成，較多的炎癥細胞浸潤，潰瘍周邊上皮細胞增生；L.lactis組小鼠結腸結構尚存在，黏膜層上皮細胞不完整，部分脫落，可見潰瘍和少量炎癥細胞浸潤等；重組L.lactis組小鼠結腸黏膜上皮修復，未見糜爛和潰瘍，僅見黏膜層內少量炎癥細胞浸潤。

組Ⅰ：正常對照組 normal control group；組Ⅱ：DSS模型對照組DSS model control group；組Ⅲ：L. lactis組L.lactis group；組Ⅳ：重組L. lactis組recombinant L. lactis group。

2.5 試驗小鼠腸道通透性相關指標及細胞因子濃度

由表1可知，與正常對照組相比，DSS模型對照組小鼠結腸occludin濃度顯著降低(P<0.05)，降低了30.43%，D-LAC濃度顯著增加(P<0.05)，DAO活性極顯著升高(P<0.01)，分別升高了60.81%和56.48%。與DSS模型對照組相比，L.lactis組小鼠結腸DAO活性、D-LAC和occludin濃度均差異不顯著(P>0.05)；重組L.lacits組小鼠結腸occludin濃度顯著增加(P<0.05)，增加了40.63%，D-LAC濃度顯著降低(P<0.05)，DAO活性極顯著降低(P<0.01)，分別降低了36.13%和26.03%。重組L.lacits組小鼠結腸D-LAC濃度和DAO活性均顯著低于L.lacits組(P<0.05)，分別降低了29.62%和17.27%。

由表1可知，與正常對照組相比，DSS模型對照組小鼠結腸IL-10濃度極顯著降低(P<0.01)，IL-4濃度顯著降低(P<0.05)，分別降低了32.19%和21.94%，TNF-α濃度極顯著增加(P<0.01)，增加了29.37%。與DSS模型對照組相比，L.lacits組小鼠結腸IL-10濃度極顯著增加(P<0.01)，增加了36.21%，而IL-4和TNF-α濃度均差異不顯著(P>0.05)；重組L.lacits組小鼠結腸IL-10濃度極顯著增加(P<0.01)，IL-4濃度顯著增加(P<0.05)，分別增加了58.87%和27.86%，結腸TNF-α濃度有降低的趨勢。與正常對照組和L.lactis組相比，重組L.lacits組小鼠結腸TNF-α、IL-10和IL-4濃度均差異不顯著(P>0.05)。

表1 口服重組L. lactis對小鼠結腸通透性相關指標及細胞因子濃度的影響

3 討 論

EGF是一種重要的細胞調控因子，可促進腸道上皮細胞增殖和分化，加速腸道創傷愈合，在消化道成熟、功能完善以及抵抗應激方面發揮重要作用。EGF具有較高的穩定性，對熱、酸具有耐受性，能抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的消化，這對其在腸道發揮生物學作用具有重要意義[5]。然而，有限的來源是限制EGF在畜牧領域研究及應用的主要原因，基因工程是獲得EGF的好方法。目前，已有報道采用大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)和畢赤酵母(Pichiapastoris，P.pastoris)系統表達pEGF。Lee等[15]采用P.pastoris成功表達pEGF，并將pEGF分泌于上清液中。賀超等[16]構建了1、2和3個pEGF拷貝數的原核重組表達質粒，不同質粒轉化E.coli后均表達了pEGF。但是采用E.coli表達pEGF多以包涵體形式存在，需經過提取、純化及復性等繁瑣處理，且內毒素較難去除；而采用P.pastoris表達系統需要甲醇誘導，還需進一步加工脫毒處理。L.lactis作為宿主菌的優勢在于它屬于食品級微生物，表達的外源蛋白以可溶性形式存在，可保持天然構型，連同菌體一起可直接口服，具有安全、方便和經濟等特點。因此，本試驗采用L.lactis高效誘導表達系統，將3個拷貝數的pEGF基因序列串聯并優化，成功構建了表達pEGF的重組L.lactis，并且重組pEGF以可溶性形式存在，Western blot分析顯示重組蛋白能夠與特異性抗體結合，初步證明L.lactis表達的pEGF具有生物活性。

本研究采用DSS誘導小鼠結腸炎模型，并同時給小鼠口服重組L.lactis，以進一步驗證重組pEGF的生物活性及對損傷腸道的修復作用。DSS結腸炎模型是目前應用最廣的一種腸炎模型，通過給小鼠飲用4～7 d的2%～5%DSS水溶液來造模，造模成功的結腸炎模型小鼠會出現腹瀉、便血、結腸縮短現象，病理檢測顯示結腸多灶性潰瘍，黏膜炎癥明顯[17]。在本研究中，飲用4%DSS溶液7 d后小鼠全部出現腹瀉及便血現象，結腸明顯縮短，組織病理檢測發現結腸嚴重潰瘍，黏膜上皮細胞大量脫落，較多炎癥細胞浸潤，說明結腸炎模型構建成功。而口服表達pEGF重組L.lacits小鼠個別出現水樣稀便，結腸長度顯著增加，HE染色發現小鼠結腸黏膜上皮修復，未見糜爛和潰瘍，僅見黏膜層內少量炎癥細胞浸潤。EGF是一類對腸道黏膜有營養、成熟和治療性作用的縮氨酸，具有促進腸上皮細胞增殖和分化，加速腸道創傷愈合的重要作用[18-19]。本課題組前期研究結果顯示，皮下注射EGF可改善DSS結腸炎模型小鼠結腸組織形態，降低結腸損傷程度評分[20]。林軍等[21]研究顯示，給結腸炎模型大鼠注射EGF并聯合飼喂谷氨酰胺，可增加組織營養和能量供給，抑制炎癥反應，對結腸黏膜具有保護作用。在本研究中，小鼠口服表達pEGF的重組L.lacits抑制了小鼠結腸的縮短，修復了腸道黏膜損傷，維持了結腸上皮結構的相對完整性。

腸道不僅是營養物質消化吸收的場所，也是阻止腸腔內細菌、毒素等有害物質入侵體內的重要屏障，屏障功能的完整性是維持腸道正常功能和動物健康的關鍵因素。occludin是腸道細胞間緊密連接(tight junction，TJ)的主要結構蛋白，與TJ的組裝、穩定性和腸道屏障功能密切相關，其濃度降低會導致腸道通透性增加、腸道屏障功能障礙等[22]。EGF具有保護腸道屏障功能完整性的作用。研究顯示，給壞死性腸炎大鼠補充EGF，EGF可通過促進杯狀細胞的成熟和黏液的產生來維持腸道損傷部位的完整性，調節腸道TJ蛋白的表達水平，改善腸道屏障功能[23]。把腸上皮細胞Caco-2暴露在甲醛溶液中，可增加Caco-2對菊糖和脂多糖的細胞旁通透性，降低occludin濃度，而補充EGF可阻止甲醛對TJ與黏合連接的破壞，提高occludin濃度[24]。在本研究中，小鼠飲用4%的DSS水溶液顯著降低了結腸occludin濃度，而口服表達pEGF的重組L.lacits顯著增加了小鼠結腸occludin濃度，并與正常對照組相比差異不顯著，說明DSS增加了結腸的通透性，破壞了腸道的屏障功能，給小鼠口服表達pEGF的重組L.lacits可降低結腸的通透性，緩解DSS對腸道屏障功能的破壞，這個結果與HE染色結果相一致。

血清DAO活性和D-LAC濃度被認為是反映腸道機械屏障完整性和受損傷程度的重要指標[25]。DAO是腸道絨毛中具有高度活性的細胞內酶，在組胺及多胺代謝中起作用；D-LAC是腸道細菌發酵產生的代謝產物。正常情況下DAO和D-LAC主要存在腸道內，當腸道屏障功能受到損傷，黏膜通透性增加，腸道內的DAO和D-LAC則通過受損的黏膜釋放到血液中，導致血清中DAO活性和D-LAC濃度升高。研究顯示，DSS能夠增加腸道通透性，誘導大鼠或小鼠血漿DAO活性和D-LAC濃度顯著升高[26-27]。在本研究中，DSS模型對照組小鼠血清DAO活性極顯著高于正常對照組，血清D-LAC濃度顯著高于正常對照組，說明了小鼠飲用4%的DSS水溶液導致腸道黏膜損傷，腸道黏膜通透性增加，而口服重組L.lacits則顯著降低了血清D-LAC濃度，極顯著降低了血清DAO活性，進一步提示表達pEGF的重組L.lacits改善了腸道的通透性，對腸道屏障具有保護作用。

細胞因子在調節腸道免疫反應中發揮重要作用，促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子間的平衡失調是導致腸道免疫機能障礙的主要原因。研究顯示，小鼠自由飲用3%的DSS水溶液10 d，結腸白細胞介素-8(IL-8)濃度顯著升高，IL-10濃度顯著降低[28]；大鼠口服3%的DSS水溶液8 d，結腸IL-4濃度顯著降低，TNF-α濃度顯著升高[29]。目前關于DSS結腸炎的具體致病機制仍不清楚，可能與巨噬細胞的功能失調、細胞因子濃度改變，以及DSS對結腸上皮的毒性作用等多種因素有關。研究顯示，IL-10具有很強的免疫調節作用，可調節Th1和Th2細胞因子的平衡，有效抑制白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)和TNF-α等促炎細胞因子的產生[30]。腸上皮細胞缺失IL-10，可導致腸道黏膜屏障損傷[31]。IL-4是由肥大細胞或活化的Th2細胞產生，可抑制細胞因子IL-6、IL-8、IL-1和TNF-α等的產生，隨著IL-4濃度升高，炎癥抑制的效果更顯著[32]。TNF-α是結腸炎致病的關鍵細胞因子，通過表達黏附分子、凝血因子等啟動細胞毒性、凋亡和急性期反應等發揮作用。在結腸炎早期抑制TNF-α產生，可減輕或阻止結腸炎的發生[33]。在本研究中，與正常對照組相比，DSS模型對照組小鼠結腸TNF-α濃度極顯著升高，IL-10濃度極顯著降低，IL-4濃度顯著降低；口服表達pEGF的重組L.lactis改善了結腸中細胞因子濃度，極顯著提高了IL-10濃度，顯著提高了IL-4濃度，并有降低TNF-α濃度的趨勢，并且上述細胞因子濃度與正常對照組比較差異不顯著。這些結果說明L.lactis表達的pEGF具有良好的生物活性，可以調節TNF-α、IL-10和IL-4濃度達到正常水平，顯著抑制了腸道炎癥反應，對損傷的腸道具有修護作用。

4 結 論

本試驗成功構建了表達pEGF的重組L.lactis，重組pEGF具有良好生物活性；結腸炎模型小鼠口服表達pEGF的重組L.lactis，可抑制結腸的縮短，改善結腸的形態結構和通透性，調節細胞因子濃度達到正常水平，維護腸道屏障功能的相對完整性，對損傷腸道具有修復作用。