不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬體況、血清生化指標(biāo)、糞便短鏈脂肪酸濃度及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

陸 江 朱道仙 劉 莉* 郝福星 吳 植 盧勁曄 盧 煒 劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，泰州 2225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰州 2225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 2225300)

隨著人們生活水平的提高，伴侶動(dòng)物犬也逐漸成為許多家庭中的一員。但因?yàn)椴涣嫉男袨榧帮嬍常瑢?dǎo)致犬能量過(guò)剩，使得肥胖癥成為犬的常見(jiàn)疾病[1]。幸運(yùn)的是，寵物飼養(yǎng)者已意識(shí)到肥胖給犬帶來(lái)的健康問(wèn)題，寵物減肥也成為寵物界關(guān)注的熱點(diǎn)。飲食干預(yù)由于經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)便及無(wú)任何副作用等優(yōu)點(diǎn)已逐漸成為寵物減肥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的新趨勢(shì)。高蛋白質(zhì)飲食干預(yù)對(duì)肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要意義[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者與瘦者的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)有顯著差異，肥胖患者有更強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力[3]。肥胖患者中腸道菌群的組成與脂肪組織褐變和胰島素作用相關(guān)，可能通過(guò)其代謝產(chǎn)物SCFAs發(fā)揮作用[4]，說(shuō)明腸道菌群及SCFAs在肥胖癥進(jìn)程中起重要作用。然而，有關(guān)高蛋白質(zhì)飲食對(duì)肥胖犬腸道菌群及SCFAs影響的報(bào)道甚少。因此，本研究比較不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬糞便SCFAs濃度及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，探究高蛋白質(zhì)飼糧對(duì)肥胖犬減重的可能新機(jī)制，為寵物減肥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

肥胖型拉布拉多獵犬，(5±1)歲，雄性，由江蘇省寵物繁育中心提供。肥胖型拉布拉多獵犬納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：通過(guò)雙能X線骨密度檢測(cè)儀(型號(hào)XR-600，美國(guó)Norland公司)檢測(cè)體脂率，體脂率>34%者視為肥胖。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取30只肥胖型拉布拉多獵犬，隨機(jī)等分為3組：低蛋白質(zhì)組(LP組)、中蛋白質(zhì)組(MP組)和

高蛋白質(zhì)組(HP組)。所有犬均以商品化成年犬糧(冠能大型成年犬犬糧，規(guī)格12 kg/袋，雀巢普瑞納寵物食品有限公司產(chǎn)品，粗蛋白質(zhì)含量≥26%)進(jìn)行15 d適應(yīng)性飼喂。然后LP組、MP組和HP組分別飼喂含20.58%(低蛋白質(zhì)飼糧)、27.77%(中蛋白質(zhì)飼糧)和39.04%(高蛋白質(zhì)飼糧)粗蛋白質(zhì)的飼糧，試驗(yàn)期為45 d。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，所有犬均單籠飼養(yǎng)，每天09：00及16：00各喂食1次，進(jìn)食時(shí)間為5 min，并且所有犬每天均在寵物訓(xùn)練場(chǎng)自由活動(dòng)15 min左右。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 體況指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)用電子稱稱量各個(gè)試驗(yàn)犬空腹體重，同時(shí)用雙能X線骨密度檢測(cè)儀測(cè)定體脂率。

1.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)空腹經(jīng)頭靜脈采集各個(gè)試驗(yàn)犬的血液，3 000 r/min離心5 min得到血清。采血當(dāng)天用試劑盒法測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量，試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司；用Catalyst Dx動(dòng)物生化分析儀(美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司)測(cè)定血清尿素氮(UN)和肌酐(Cr)含量。

1.5 糞便樣本采集及糞便SCFAs濃度測(cè)定

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)無(wú)菌收集直腸中糞便，分為2份，分別放入10 mL凍存管并迅速放入液氮中保存。一份用于檢測(cè)SCFAs濃度，另一份用于腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序。樣品采集完畢后立即轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

糞便中SCFAs濃度的測(cè)定采用氣相色譜法(Agilent 6890N氣相色譜儀，美國(guó))。準(zhǔn)確稱取1 g樣品，加4 mL超純水，振蕩混勻30 min后，12 000 r/min將上清液轉(zhuǎn)移，重復(fù)以上步驟1次，合并上清液并定容到10 mL離心管中。取4.5 mL上清液，按9∶1體積比在樣品中加入25%偏磷酸，固定3 h以上，然后12 000 r/min離心10 min，45 μm濾膜過(guò)濾加入上機(jī)瓶。色譜條件：采用DB-1 ms毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，載氣為氮?dú)猓髁繛? mL/min，輔助氣為氫氣，火焰離子檢測(cè)器(FID)溫度280 ℃，分流比50∶1，進(jìn)樣量2 μL。色譜程序升溫步驟如下：初始溫度40 ℃，接著以5 ℃/min的速度升至70 ℃，維持3 min，再以20 ℃/min的速度升至160 ℃，維持3 min，最后以35 ℃/min的速度升至280 ℃，維持3 min。

1.6 腸道菌群16S rDNA高通量測(cè)序

1.6.1 糞便總DNA提取與PCR

稱取無(wú)菌糞便樣品100 mg，采用Qiagen DNA試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取總DNA，再以獲得的細(xì)菌DNA為模板對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下游引物序列為5′-GGACTACGCGGGTATCTAAT-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，6個(gè)循環(huán)；92 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃擴(kuò)展延伸10 min，4 ℃保存。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，用于后續(xù)操作。

1.6.2 Illumina高通量測(cè)序及處理

1.6.3 生物信息分析

用QIIME(version 1.9.1)[7]分析腸道菌群α多樣性，用基于weighted UniFrac matrices的主坐標(biāo)分析(PCoA)進(jìn)行β多樣性分析[8]，用STAMP分析組間差異菌群[9]，用PICRUSt預(yù)測(cè)菌群基因組功能[10]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

計(jì)量資料用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和組間兩兩比較，組內(nèi)試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，腸道菌群豐度比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，用Pearson法分析相關(guān)性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬體重及體脂率的影響

從表2可以看出，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組犬的體重及體脂率均無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組犬體重及體脂率均低于MP組和LP組(P<0.05)，同時(shí)MP組也顯著低于LP組(P<0.05)。與試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組犬的體重(P=0.047)及體脂率(P=0.012)顯著降低，LP組和MP組的體重及體脂率則無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表2 體重及體脂率的變化

2.2 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組犬的血清生化指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組犬的血清TG、TC及LDL含量均顯著低于MP組和LP組(P<0.05)，同時(shí)MP組也顯著低于LP組(P<0.05)，其他血清生化指標(biāo)在3組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比，HP組犬血清LDL含量極顯著降低(P=0.001)，血清TG含量顯著降低(P=0.041)，血清UN含量極顯著升高(P=0.002)，MP組和LP組各血清生化指標(biāo)則無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表3 血清生化指標(biāo)的變化

2.3 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬糞便中SCFAs濃度的影響

由圖1可知，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組糞便中乙酸濃度極顯著低于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(P<0.01)，且極顯著低于同期LP組和MP組(P<0.01，圖1-a)；無(wú)論是試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)還是結(jié)束時(shí)，各組間丙酸濃度均無(wú)顯著變化(P>0.05，圖1-b)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組糞便中丁酸濃度顯著高于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(P<0.05)，且顯著低于同期LP組和MP組(P<0.05，圖1-c)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組糞便中總SCFAs濃度顯著低于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(P<0.05)，且顯著低于同期LP組和MP組(P<0.05，圖1-d)。體脂率與糞便中總SCFAs(r=0.389)和乙酸濃度(r=0.752)呈正相關(guān)關(guān)系(圖1-e、圖1-f)，與糞便中丁酸濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.395，圖1-g)。

P1：試驗(yàn)開(kāi)始；P2：試驗(yàn)結(jié)束。LP：LP組；MP：MP組；HP：HP組。“a”表示兩組間差異顯著(P<0.05)，“aa”表示兩組間差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.4 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬腸道菌群多樣性的影響

觀察物種數(shù)、Chao1指數(shù)及Simpson指數(shù)是反映腸道菌群ɑ多樣性的主要指標(biāo)。腸道菌群觀察物種數(shù)、Chao1指數(shù)無(wú)論是組內(nèi)試驗(yàn)開(kāi)始與結(jié)束時(shí)比較還是同期組間比較均無(wú)顯著差異(P>0.05，圖2-a、圖2-b)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)HP組腸道菌群Simpson指數(shù)顯著高于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)以及同期LP組和MP組(P<0.05，圖2-c)。PCoA是反映腸道菌群β多樣性的指標(biāo)，可直觀顯示不同組間微生物進(jìn)化上的相似性及差異性，距離越近相似性越高，距離越遠(yuǎn)差異性越大。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，3組樣本間距離較近，主坐標(biāo)成分1(PCo1)可以解釋最大51.48%數(shù)據(jù)變化，說(shuō)明各組犬腸道菌群在試驗(yàn)開(kāi)始具有相似性(圖2-d)；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，HP組樣本遠(yuǎn)離LP組和MP組樣本，說(shuō)明HP組腸道菌群與LP組、MP組有差異(圖2-e)。

圖2 腸道菌群多樣性的變化

2.5 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬腸道菌群組成的影響及差異菌屬分析

在門(mén)水平，各組犬腸道優(yōu)勢(shì)菌群主要分布在5個(gè)門(mén)，分別是厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)(圖3-a)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與LP組、MP組比較，HP組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05，圖3-c)，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05，圖3-d)，擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值顯著降低(P<0.05，圖3-e)。在科水平，梭桿菌科、擬桿菌科、普雷沃菌科等相對(duì)豐度較高，為各組犬腸道優(yōu)勢(shì)菌群(圖3-b)。在屬水平，HP組梭菌屬、瘤胃球菌屬、普拉梭菌屬及漫游球菌屬相對(duì)豐度極顯著高于LP組(P<0.01，圖4-a)，梭菌屬、多爾氏菌屬、瘤胃球菌屬、普拉梭菌屬及擬桿菌屬相對(duì)豐度極顯著高于MP組(P<0.01，圖4-b)；MP組普拉梭菌屬、別樣棒菌屬及普雷沃菌群相對(duì)豐度極顯著高于LP組(P<0.01，圖4-c)。

圖3 腸道菌群在門(mén)水平和科水平的組成

圖4 不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬腸道菌屬的影響

2.6 腸道菌群基因功能預(yù)測(cè)分析

圖5 腸道菌群基因功能預(yù)測(cè)分析(KEGG通路第3層級(jí))

3 討 論

遺傳因素和飲食模式是影響動(dòng)物肥胖癥發(fā)生發(fā)展的兩大重要因素。現(xiàn)階段，已有多種飲食干預(yù)方法用于超重和肥胖的治療，如高蛋白質(zhì)飲食。王雙等[11]通過(guò)為期4周的短期高蛋白質(zhì)飲食干預(yù)發(fā)現(xiàn)，受試者體重和體脂率均有所降低，且對(duì)肥胖患者血液中TG、LDL含量的改善效果更好。劉闖[12]研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)飼糧有助于降低高脂誘導(dǎo)肥胖SD大鼠體脂率。在本研究中，飼喂高蛋白質(zhì)飼糧肥胖犬在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的體重、體脂率以及血清中TG與LDL含量均低于LP組、MP組及自身試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，說(shuō)明高蛋白質(zhì)飼糧對(duì)肥胖犬具有減重效果，與上述報(bào)道結(jié)論相一致。此外，高蛋白質(zhì)飼糧對(duì)肥胖犬血清Cr含量無(wú)顯著影響，僅血清UN含量輕度升高，這可能與蛋白質(zhì)攝入有關(guān)。

SCFAs是由回腸末端和結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等，約95%的SCFAs經(jīng)結(jié)腸吸收入血液循環(huán)，然后代謝為機(jī)體提供5%～10%的能量[13]。其中，丁酸被結(jié)腸上皮細(xì)胞利用作為其主要能量來(lái)源；丙酸則被吸收運(yùn)送至肝臟進(jìn)行糖、脂代謝，并且能夠抑制膽固醇的合成；乙酸經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟代謝為乙酰輔酶A，是脂肪與膽固醇合成重要的底物[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖兒童糞便SCFAs的濃度比體重正常的人高[15]，動(dòng)物試驗(yàn)也表明肥胖鼠相比正常鼠糞便中SCFAs濃度更高[16]，尤其是高濃度的乙酸，可激活副交感神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)胰島素、胃饑餓素的分泌，進(jìn)而引起食欲過(guò)盛、肥胖和相關(guān)后遺癥[17]。也有研究表明，丁酸可以刺激胰腺分泌[18]，增加胰高血糖素和胰島素水平，提高胰島素敏感性，從而改善糖、脂代謝，減少脂肪堆積。在肥胖小鼠模型中，口服丁酸鹽可有效預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肥胖、胰島素抵抗、高甘油三酯血癥和肝臟脂肪變性等[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖犬體脂率與糞便中總SCFAs、乙酸濃度呈正相關(guān)，與丁酸濃度呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)論相一致，提示SCFAs與犬肥胖有密切關(guān)系。高蛋白質(zhì)飼糧可以降低肥胖犬糞便中總SCFAs及乙酸濃度，提高丁酸濃度。

動(dòng)物胃腸道內(nèi)有大量微生物，特別是結(jié)腸部位，微生物豐度最高，特定腸道微生物的代謝活動(dòng)可能對(duì)動(dòng)物的消化吸收、體重變化及一系列生理過(guò)程產(chǎn)生重要影響[20-21]。糞便菌群與結(jié)腸中菌群組成相似[22]，且糞便樣本易采集，因此通過(guò)糞便中菌群結(jié)構(gòu)來(lái)反映腸道菌群結(jié)構(gòu)是許多研究人員選用的方法[23]。本研究通過(guò)檢測(cè)糞便中菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)高蛋白質(zhì)飼糧未能改變肥胖犬腸道菌群的豐富度，但提高了腸道菌群的均勻度，與楊鳳嘯等[24]研究得出的高脂飼糧誘導(dǎo)肥胖小鼠腸道菌群多樣性降低的結(jié)論相似。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同蛋白質(zhì)水平飼糧對(duì)肥胖犬在門(mén)水平的核心菌群組成影響不大，但菌群豐度發(fā)生改變，HP組厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度增加，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度降低，擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值降低，這種變化可促進(jìn)體重減輕[6]。在屬水平，梭菌屬及普拉梭菌屬等細(xì)菌主要富集在HP組。梭菌屬具有較強(qiáng)的產(chǎn)丁酸能力[25]，這可能也是HP組糞便中丁酸濃度升高的主要原因，普拉梭菌屬有改善肥胖的作用[26]。腸道菌群基因功能分析發(fā)現(xiàn)，HP組的黃酮和黃酮醇生物合成、色氨酸代謝及檸檬烯和蒎烯降解等第3層級(jí)KEGG通路上調(diào)，而這些通路均與機(jī)體脂肪代謝有關(guān)[27]。

4 結(jié) 論

高蛋白質(zhì)飼糧可改善肥胖犬腸道菌群結(jié)構(gòu)及短鏈脂肪酸代謝，有減重降脂作用。