添加乳酸菌和纖維素酶對豆渣與桑葉混貯品質及體外瘤胃發酵特性的影響

趙 超 馬廣明 呂靜怡 姜 鑫 張永根

(東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 2150030)

豆渣(soybean residue，SR)是豆腐、豆漿、腐乳等豆制品加工過程中產生的副產品，在我國產量極為豐富，且非纖維碳水化合物和蛋白質含量高，因而具有很高的營養價值[1]。然而由于新鮮SR含水量大，導致其很難長期保存，因而限制了其在動物飼糧中的應用[2]。目前，青貯發酵是對含水量較高飼料進行長期保存的一種經濟有效的方式，這種方式不僅可以緩解廢物處理問題，還可以提高動物飼料的利用[3]。但飼料含水量過高，導致青貯過程中不良微生物大量繁殖，進而影響飼料的發酵品質[4]。由于SR的含水量過高(大于80%)，因而在青貯發酵時需將其與一些干物質(DM)含量較高的非常規飼料混合，以調整水分含量，進而達到最佳青貯條件。桑葉(mulberry leaf，ML)作為一種非常規飼料資源，在我國產量極為豐富[5]，目前主要是將新鮮ML曬干、磨碎制成桑葉粉后用于動物飼料中，這種方式簡單、方便、易操作。然而，ML高粗纖維含量和一些抗營養因子能抑制動物對營養物質的消化吸收[6]，從而限制其在動物飼喂中的應用。因此，將SR與ML進行混合青貯，既可以調整水分含量，延長保存時間，還可以改善飼料的營養價值，這對于提高我國飼料資源利用具有重要意義。

微生物青貯技術可以抑制不良微生物生長、延長貯存時間并減少氨態氮(NH3-N)的產生[7]。崔彥召[8]研究表明，添加乳酸菌(LAB)不僅可以有效地改善發酵全混合日糧青貯的發酵品質和風味，還能夠有效降低其霉菌毒素的含量，從而提高發酵全混合日糧青貯的營養價值和飼喂安全性。王昆昆等[9]發現添加LAB可以降低不同比例苜蓿和披堿草混貯的NH3-N含量，提高水溶性碳水化合物(WSC)含量，從而提高其發酵品質。纖維素酶(cellulose，CE)是一種復合酶，可增加發酵糖的供應量，為LAB快速繁殖提供底物，加速pH降低，從而進一步提高青貯發酵品質。李春霞[10]發現在甘蔗梢青貯中添加纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶均能降低中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量，提高糖的生成量，進而大幅改善青貯發酵品質。Wang等[11]發現將紫花苜蓿與全株玉米混合青貯可降低不良微生物數量，提高發酵品質及有氧穩定性。

然而，目前有關LAB與CE的組合添加對SR和ML混貯發酵品質的影響鮮有報道，需進一步研究。為此，本試驗評價了LAB和CE添加對SR與ML混合青貯發酵品質及體外瘤胃發酵特性的影響，以期為SR和ML的合理飼用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料調制和樣品采集

1.1.1 試驗材料

混貯原料：試驗所用SR和ML均購自哈爾濱某股份有限公司。復合乳酸菌劑：由東北農業大學反芻動物營養研究所提供。CE：10 000 U/g，購于哈爾濱某生物技術有限公司。

1.1.2 青貯飼料調制

將SC與ML按比例在玻璃盆中混合均勻，以鮮重為基礎，調整含水量為65%。試驗設置4個組，分別為對照組(CON組)、LAB組、CE組及LAB+CE組，每組3個重復，其中LAB和CE添加量分別為1×106CFU/g和100 U/g。各組中各添加劑均充分溶解在10 mL蒸餾水中，隨后用微型噴霧器噴灑在2 kg混合青貯上，CON組只噴灑10 mL蒸餾水。混合均勻后，將飼料放入聚乙烯袋(40 cm×50 cm)中，并用食品真空封口機密封，置于室溫(28±3) ℃下進行8周青貯發酵。

1.2 樣品分析

1.2.1 微生物分析

發酵完成后取出樣品，采用平板計數法對混合青貯飼料進行微生物分析[12]。首先，取樣品10 g加入90 mL滅菌生理鹽水中進行提取。其次，將提取液稀釋為9個梯度(10-1～10-9)，并選取3個最適稀釋倍數進行細菌群落計數。最后，取不同濃度的稀釋液100 μL在MRS瓊脂培養基和紫紅色膽汁(VRB)瓊脂培養基上均勻涂布，然后置于厭氧培養盒中30 ℃恒溫培養48 h后進行LAB計數。與上述操作方法一致，分別通過孟加拉紅培養基(Rose Bengal agar)和PDA瓊脂培養基培養后進行酵母菌和霉菌計數(在28 ℃下培養72 h)。

1.2.2 發酵品質分析

取20 g樣品置于180 mL蒸餾水中勻漿1 min，經4層紗布過濾，制得青貯飼料并在4 ℃下保存過夜，然后用定性濾紙過濾。所得濾液立即用Sartorius PB-10型pH測定儀測定pH。濾液在4 ℃，12 000×g條件下離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀(Waters-600，日本)進行乳酸(LA)含量測定。采用氣相色譜儀(島津GC-2010，日本)分析濾液中乙酸(AA)含量。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定[13]。

1.2.3 化學成分分析

將取出的樣品置于65 ℃烘箱中干燥48 h，然后用研磨機研磨過1 mm篩網。根據AOAC(1990)中描述的方法，測定樣品DM含量，并計算干物質回收率(DMR)。使用凱氏定氮儀(Foss，2300自動分析儀，瑞典)測定樣品粗蛋白質(CP)含量[14]。按照Van Soest等[15]所描述的方法，采用纖維分析儀(ANKOM)測定樣品NDF和ADF含量。WSC含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法進行測定[16]。鈣(Ca)和磷(P)含量分別參考國際標準ISO 27085—2009(高錳酸鉀法)和GOST R 50852—1996(磷釩鉬酸比色法)進行測定。

1.3 體外發酵

稱取0.5 g樣品放入經105 ℃烘干2 h恒重后的F75(北京正方興達科技有限公司)濾袋中并進行封口。然后在早上飼喂前，從3頭裝有永久性瘤胃瘺管的奶牛瘤胃中收集新鮮瘤胃液(奶牛基礎飼糧組成及營養水平見表1)，并迅速帶回實驗室，整個過程中瘤胃液一直處于39 ℃下厭氧保存。根據Menke等[17]的報道配制緩沖溶液，并將飽和的二氧化碳(CO2)通入配制好的緩沖液中直至緩沖液呈無色透明，此期間緩沖液一直置于39 ℃水浴鍋中。隨后將緩沖液與瘤胃液按2∶1的比例混合均勻，配制發酵液。將裝有樣品的濾袋與30 mL發酵液放入對應編號的發酵瓶中，通入CO2后擰緊瓶蓋，并在蓋口涂抹少許石蠟，以防出現漏氣的情況。將產氣記錄裝置(Cerabar T PMP131)和Alltech公司記錄系統相連接，以準確記錄產氣量。發酵瓶在39 ℃條件下連續培養48 h，且每個樣品5個重復并設置3個空白，并在0、2、4、8、12、16、24、36和48 h時記錄產氣數值。體外發酵結束后，立即使用pH測定儀測定發酵液pH，隨后取20 mL發酵液平均分裝于2個15 mL離心管中，并分別加入2 mL 25%的偏磷酸，充分混勻后置于-20 ℃保存，直至用于揮發性脂肪酸(VFA)和NH3-N含量測定，測定方法與上述飼料測定相同[18]。將濾袋取出后立即沖洗至沖洗液清澈無味，隨后置于烘箱內烘干(105 ℃，4 h)，恒重后稱重，用于測定干物質回收率。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.4 產氣量和產氣參數計算

發酵后產氣量計算公式如下：

GPt=(Vt-V0)/W。

式中：GPt指混貯后樣本在t時間共積累的產氣量(mL/g)；Vt為混貯后樣本在t時間段產氣量(mL/g)；V0為t時間段空白產氣量(mL/g)；W為發酵底物的質量(g)。

產氣參數根據?rskov等[20]提出的產氣模型計算：

GP=a+b(1-exp-ct)。

式中：GP表示t時間點的累計產氣量(mL/g)；a表示快速產氣部分(mL/g)；b表示慢速產氣部分(mL/g)；c表示產氣速率(mL/h)。

1.5 數據處理及統計分析

數據采用SAS軟件包(Version 9.4)中的GLM程序進行分析。采用Turkey’s作顯著性檢驗，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 青貯原料化學組成

如表2所示，SR與ML的DM含量分別為16.52%和89.32%，且pH均大于6.0。SC中NDF和ADF含量均高于ML，但WSC含量較低，僅為2.5%。SR中檢測到LAB和酵母菌菌落數分別為2.31和2.54 lg(CFU/g)，但未檢測到霉菌。ML中霉菌和酵母菌菌落數分別為2.17和4.47 lg(CFU/g)，而SR和ML中大腸桿菌菌落數均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。

表2 混合青貯前SR和ML的營養組成及微生物群落數(干物質基礎)

2.2 青貯飼料化學成分分析

由表3可知，與CON組相比，CE組與LAB+CE組DM含量顯著提高(P<0.05)，而與LAB組相比無顯著差異(P>0.05)。LAB組、CE組及LAB+CE組CP含量較CON組分別提高16.45%、11.30%、19.60%(P<0.05)。與CON組相比，各試驗組ADF含量顯著下降(P<0.05)，且CE組和LAB+CE組NDF含量顯著降低(P<0.05)，但LAB組NDF含量無顯著變化(P>0.05)。此外，各試驗組間WSC含量差異并不顯著(P>0.05)，但均較CON組略微降低。

表3 LAB和CE對SR與ML混貯的化學成分的影響(干物質基礎)

2.3 青貯飼料發酵品質分析

由表4可知，與CON組相比，LAB+CE組干物質回收率顯著提高(P<0.05)，而LAB組和CE組間無顯著差異(P>0.05)。各試驗組pH均較CON組顯著降低(P<0.05)，其中LAB+CE組達到最低，LAB組和LAB+CE組之間差異不顯著(P>0.05)。與CON組相比，LAB組和LAB+CE組NH3-N含量均顯著下降(P<0.05)，與CON組相比，各試驗組乳酸含量均顯著提高(P<0.05)，且LAB+CE組達到最高。各試驗組乙酸含量均顯著高于CON組(P<0.05)，且LAB+CE組達到最高。

表4 LAB和CE對SR與ML混貯的發酵品質影響

2.4 青貯飼料微生物群落變化

由表5可知，混貯后CON組、LAB組、CE組、LAB+CE組的LAB菌落數分別為7.33、8.02、7.98和8.75 lg(CFU/g)。大腸桿菌菌落數除CON組為2.21 lg(CFU/g)外，其余各組均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。酵母菌菌落數在各試驗組中均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]，但在CON組中檢測值為3.04 lg(CFU/g)。LAB組和LAB+CE組均未檢測到霉菌，且CON組和CE組霉菌菌落數均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。

2.5 LAB和CE對SR與ML混貯體外發酵產氣量影響

由表5可知，隨發酵時間延長各組產氣量均呈現上升趨勢。與CON組相比，發酵2 h時LAB組產氣量顯著升高(P<0.05)，而其他組無顯著變化(P>0.05)。發酵4 h后，各試驗組產氣量均較CON組升高，且LAB+CE組產氣量在各時間點均顯著高于CON組(P<0.05)。與CON組相比，各試驗組快速發酵部分產氣量(a)和慢速發酵部分產氣量(b)均較CON組顯著增加(P<0.05)，且LAB+CE組達到最高。除CE組外，其他各試驗組潛在產氣量(a+b)均顯著高于CON組(P<0.05)，且LAB+CE組最高。此外，LAB組和CE組有效產氣速率(c)均較CON組顯著降低(P<0.05)，但LAB+CE組無顯著變化(P>0.05)。

表5 LAB和CE對SR與ML混貯的微生物群落影響

表6 LAB和CE對SR與ML混貯的產氣量及產氣參數的影響

2.6 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發酵參數影響

由表7可知，LAB組和CE組發酵液中乙酸、丙酸和丁酸含量均較CON組顯著升高(P<0.05)，但各試驗間差異不顯著(P>0.05)。與CON組相比，各試驗組發酵液中總揮發性脂肪酸含量顯著提高(P<0.05)，且LAB+CE組產量最高。各試驗組乙酸/丙酸均較CON組顯著降低(P<0.05)，且LAB組達到最低。

表7 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發酵特性的影響

3 討 論

3.1 LAB和CE對SR與ML混貯飼料化學組成的影響

本試驗中，LAB組和LAB+CE組DM含量均較CON組顯著升高，原因可能是由于LAB在混貯過程中能產生更多的乳酸，從而導致pH快速降低，抑制不良微生物生長，進而減小DM流失[21]。各試驗組WSC含量均較CON組降低，原因可能是由于LAB在混貯發酵過程中會消耗大量的WSC，從而促進LAB快速生長與繁殖，進而促進有機酸的產生。王力生等[22]研究指出添加微生物制劑能夠顯著降低筍殼青貯中WSC含量，與本研究結果一致。NDF和ADF是反映飼料中纖維質量好壞的重要指標。由于ADF在動物體內很難消化吸收，所以ADF含量越低，說明混貯發酵質量越高[23]。本試驗中，LAB+CE組中NDF和ADF含量較CON組顯著降低。一方面可能是由于CE添加促進了SR和ML混貯中纖維的降解；另一方面可能是由于LAB在混貯發酵過程中會降解碳水化合物產生CO2，從而導致纖維含量降低。這與趙華等[24]試驗結果相符。同時Mu等[25]指出，CE與LAB混合添加對高水分莧菜和稻草混合青貯的化學成分、細菌群落及有氧穩定性均好于單一添加LAB。以上研究結果表明LAB和CE添加能夠提高SR和ML混貯的營養價值。

3.2 LAB和CE對SR與ML混貯飼料發酵品質的影響

在混貯發酵過程中，梭菌等不良微生物的存在會抑制LAB生長，促進丁酸產生，引起乳酸發酵路線出現偏離，從而導致蛋白質降解為NH3-N，進而引起飼料營養流失[26]。本試驗中，LAB+CE組NH3-N含量較CON組顯著降低，原因可能是添加CE能夠將纖維降解為WSC，從而為LAB生長提供充足的營養物質，促進乳酸產生，進而抑制梭菌等不良微生物在混貯飼料中生長。此外，本研究中LAB組、CE組和LAB+CE組均為未檢測到丁酸也證實了這一假設。

pH是評價青貯發酵質量好壞的重要指標，其變化取決于青貯DM、化學成分和青貯周期。Nishino等[27]研究發現添加LAB可顯著降低全混合日糧青貯的pH，從而提高其發酵品質和有氧穩定性。本試驗中，各試驗組間pH均低于4.00，原因可能是接種LAB增加了初始乳酸菌數量，從而促進乳酸產生，進而導致pH下降[28]。Zhang等[29]試驗結果表明添加干酪乳桿菌能夠降低羊草青貯的pH，這與本研究結果相似。同時，Liu等[30]評估了添加劑對全混合日糧青貯發酵品質的影響，發現添加干酪乳桿菌和纖維素酶的全混合日糧青貯中乳酸含量達到3.8%(DM)，這與本試驗中添加LAB和CE混貯產生的乳酸含量(4.12% DM)相近。Nishino等[31]在水分含量較高(85.5%)的豚草青貯飼料中觀察到較高的乙酸含量(5.64 g/kg DM)。與此不同，本研究中3個試驗組的乙酸含量較低。這種差異可能是由于混貯飼料中的細菌群落來自不同的環境、自身特性或原料上的微生物數量不同所致[32]。然而，菌酶協同改善飼料混貯發酵品質的機理還有待進一步研究。

一般來說，是否需要向青貯飼料中加入添加劑取決于附著在青貯飼料上的微生物數量和種類[33]。對于保存較好的混貯飼料，混貯時LAB的菌落數至少達到1×105CFU/g[34]。然而，在原料中觀察到SR的LAB菌落數僅為2.3 lg(CFU/g)。ML的LAB菌落數低于2.00 lg(CFU/g)，且不良微生物數量較高，這可能影響發酵品質。為保證混貯飼料快速發酵并抑制有害微生物的生長，在青貯飼料發酵的早期階段，需要通過加入添加劑，如LAB或CE，提高LAB發酵能力，使其主導微生物發酵。

3.3 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發酵特性的影響

混貯經瘤胃微生物發酵后的產氣量是評價混貯可發酵程度的重要指標，因為混貯后飼料產氣量與養分可消化程度呈正相關[35]。本試驗結果表明，LAB+CE組體外產氣量較對照組顯著升高，說明LAB和CE添加具有提高SR和ML混貯體外瘤胃消化率的潛力。一般來說，穩定的內部環境是保證瘤胃功能正常的必要條件，而pH則是反映瘤胃內部環境的主要指標，當pH不在正常范圍內時，瘤胃微生物的活性就會受到影響[36]。本試驗中，LAB+CE組和CE組發酵液pH顯著降低，但仍處于正常范圍內，說明瘤胃發酵環境處于穩定狀態，能促進微生物的生長和代謝。本研究中瘤胃pH下降可能主要因為VFA的產生，且隨著在混貯中添加LAB和CE，VFA含量顯著提高，進而導致pH呈降低趨勢。LAB+CE組VFA含量增加的原因可能是由于LAB和CE添加促進了混貯飼料中碳水化合物在瘤胃中的降解，進而改善瘤胃發酵。

4 結 論

本試驗結果表明，LAB與CE組合添加可提高SR和ML混貯飼料乳酸和粗蛋白質含量，降低NH3-N含量和pH，從而提高其營養價值。此外，SR和ML混貯中添加LAB和CE后其體外瘤胃發酵特性也得到改善。因此，LAB和CE混合添加可大幅改善SR和ML混貯品質，使其具有應用在奶牛生產中的潛力。