亞急性瘤胃酸中毒對綿羊瘤胃異常代謝產物、瘤胃菌群和血液相關指標的影響

韓郭皓 高曉莎 段晉偉 張慧琴 鄭 巖 馬林峰 何金鑫 霍乃蕊 裴彩霞 古少鵬*

(1.山西農業大學動物醫學學院，太谷 2030801；2.山西農業大學動物科學學院，太谷 2030801)

亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)是高產反芻動物群體中常見的營養代謝性疾病，綿羊育肥養殖過程中，為達最大生產性能常飼喂大量高精飼糧，高精飼糧發酵導致瘤胃內揮發性脂肪酸以及乳酸等有機酸積累，瘤胃pH長時間處于較低水平，綿羊發生SARA[1]。SARA會導致瘤胃液pH下降、瘤胃微生物菌群紊亂、機體組織器官產生炎癥、生產性能降低、動物淘汰或死亡等情況發生[2-4]。SARA早期通常沒有典型癥狀，診斷較為困難，瘤胃液pH 5.2～5.6持續3 h以上為SARA主要判定依據[5]。SARA發生機制包括乳酸中毒學說以及內毒素組胺中毒學說[6]。研究報道，奶牛SARA可引起瘤胃液乳酸、組胺和內毒素含量顯著增加，但血液乳酸、組胺和內毒素含量變化不顯著[7-8]；而曾光[9]通過梯度增加精粗比誘導山羊SARA，發現瘤胃液及血液乳酸、組胺和內毒素含量均顯著升高。瘤胃內環境失衡通常會導致瘤胃菌群發生改變，Kim等[10]飼喂高谷物飼糧誘導奶牛SARA，顯示瘤胃菌群多樣性指數下降，普雷沃氏菌屬的相對豐度降低。目前，關于SARA的發生及其機制研究多集中于奶牛[11-13]和山羊[14-16]，模型多以短期高谷物飼糧誘導，誘導過程與疾病發生發展不符，SARA綿羊瘤胃異常代謝產物及菌群、血氣和血清生化指標等如何變化鮮有報道，其發生機制尚不清楚。因此，本研究通過逐步提升飼糧精粗比建立綿羊SARA模型，分析SARA對綿羊瘤胃異常代謝產物、瘤胃菌群、血氣和血清生化指標的影響，探究綿羊SARA狀態下瘤胃內環境和機體狀況，為防治綿羊SARA提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1.2 動物設計

試驗前綿羊分為2組，分別為SARA誘導組(n=35)與對照組(CK組，n=15)。預試期30 d，飼喂精粗比為50∶50的基礎飼糧。SARA誘導組通過飼糧精粗比遞增誘導綿羊發生SARA，飼糧精粗比依次為50∶50、70∶30、80∶20、90∶10和100∶0，各精粗比飼糧均飼喂7 d，瘤胃液pH 5.2～5.6持續3 h以上的綿羊構成SARA模型組；CK組飼喂精粗比為50∶50的基礎飼糧。每日06：00和17：00飼喂，每只羊每日約采食1.55 kg飼糧。飼糧參照《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)配制，各精粗比飼糧組成及營養水平見表1。

表1 各精粗比飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目Items精粗比 Concentrate to forage ratio50∶5070∶3080∶2090∶10100∶0鈣 Ca0.560.520.490.470.45磷 P0.230.240.260.250.26鈣磷比 Ca/P2.432.171.881.881.65

1.3 臨床觀察與樣品采集測定

1.3.1 臨床觀察

每日觀察綿羊精神和糞便狀態，采集瘤胃液時觀察其顏色、氣味和黏稠度，并記錄。

1.3.2 樣品采集

于各飼喂期第7天晨飼后1、2、3、4、5、6和8 h使用瘤胃液口腔采樣器(A1164K，武漢科立博牧業科技有限公司)抽取瘤胃液，每只50 mL，4層紗布過濾保存。模型構建成功后，于晨飼前用BD PresetTM采血器和含促凝劑的采血管采集頸靜脈血液。

1.3.3 樣品測定

1.4 數據分析

測序數據使用Qiime 1.9.1軟件進行處理分析。有效測序數據以97%的一致性聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，使用SILVA 132數據庫進行物種注釋。Alpha分析使用wilcox秩和檢驗進行統計分析。數據使用Excel 2019整理，統計分析應用SPSS 26.0軟件中獨立樣本t檢驗及單因素方差分析，多重比較采用Duncan氏法。數據以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結 果

2.1 SARA綿羊模型建立

由表2可見，SARA誘導組瘤胃液pH隨飼糧精粗比提高而降低，精粗比為100∶0時共有27只綿羊瘤胃液pH在5.2～5.6持續3 h以上。臨床觀察，CK組綿羊未見明顯異常，瘤胃液較稀薄，氣味微臭，色澤偏綠(圖1-A)，糞便為較硬顆粒狀(圖1-C)；SARA誘導組在精粗比為100∶0時部分綿羊瘤胃液較濃稠，氣味惡臭，色澤偏黃(圖1-B)，輕度腹瀉，糞便稀軟不成形(圖1-D)，精神狀態未見明顯異常。綜上判定，SARA誘導組的27只綿羊在精粗比為100∶0時發生SARA，構成SARA模型組[5]。

A：健康綿羊瘤胃液 rumen fluid of healthy sheep；B：SARA綿羊瘤胃液 rumen fluid of SARA sheep；C：健康綿羊糞便 feces of healthy sheep；D：SARA綿羊糞便 feces of SARA sheep。

表2 SARA對綿羊瘤胃液pH的影響

2.2 SARA對綿羊瘤胃液乳酸、組胺和內毒素含量的影響

由表3可見，瘤胃液乳酸、組胺和內毒素含量隨飼糧精粗比提高而增加，SARA模型組瘤胃液乳酸、組胺和內毒素含量均顯著高于CK組(P<0.05)。

表3 SARA對綿羊瘤胃液乳酸、組胺和內毒素含量的影響

2.3 SARA對綿羊瘤胃菌群的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析

由表4可見，隨飼糧精粗比提高，瘤胃菌群豐富度指數(Chao1指數)和多樣性指數(Shannon指數)下降。SARA模型組Chao1指數顯著低于CK組(P<0.05)。

表4 SARA對綿羊瘤胃菌群Alpha多樣性的影響

2.3.2 Beta多樣性分析

非度量多維標度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析基于Weighted Unifrac距離，SARA模型組位于第1及第4象限，與CK組距離較遠(圖2-A)；主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)基于Bray Curtis距離，獲得主坐標1(PC1)的貢獻率為17.14%，SARA模型組位于第4象限，樣本較為集中，與CK組距離較遠(圖2-B)。

A：非度量多維標度分析 NMDS analysis；B：主坐標分析 PCoA。

2.3.3 門水平與屬水平下瘤胃菌群結構分析

門水平下，SARA誘導組在精粗比為90∶10時最優菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，其余各組最優菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)；與CK組相比，SARA模型組厚壁菌門、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低(圖3-A)。屬水平下，SARA誘導組在精粗比為90∶10時最優菌屬為Pseudoscardovia，其余各組最優菌屬為普雷沃氏菌科未確定菌屬(unidentified Prevotellaceae)；與CK組相比，SARA模型組普雷沃氏菌科未確定菌屬、羅氏菌屬(Roseburia)和Pseudoscardovia相對豐度增加(圖3-B)。SARA模型組在屬水平下，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Pseudoscardovia為具有生物學及統計學意義的差異物種(圖3-C)。

A：門水平菌群結構堆積柱狀圖 stacking histogram of bacterial community structure at phylum level；B：屬水平菌群結構堆積柱狀圖 stacking histogram of bacterial community structure at genus level；C：線性判別分析分枝進化圖 LEfSe analysis branching evolution diagram。

2.3.4 Tax4Fun功能預測

由圖4可見，SARA模型組瘤胃菌群代謝相關二級功能層基因富集存在差異，與CK組相比，主要體現在碳水化合物代謝相關基因的相對豐度升高，輔助因子和維生素的代謝、脂質代謝、其他次生代謝產物的生物合成和其他氨基酸的代謝相關基因的相對豐度降低。

圖4 代謝相關功能基因預測熱圖

2.4 SARA對綿羊血氣分析的影響

由表5可見，血氣分析結果顯示，SARA模型組血液乳酸含量顯著高于CK組(P<0.05)，SARA模型組血液二氧化碳總量、實際碳酸氫鹽及全血堿剩余含量均顯著低于CK組(P<0.05)。

表5 SARA對綿羊血氣分析的影響

2.5 SARA對綿羊血清生化指標的影響

由表6可見，SARA模型組血清組胺和內毒素含量顯著高于CK組(P<0.05)，血清谷丙轉氨酶活性顯著低于CK組(P<0.05)，其余血清生化指標與CK組差異不顯著(P>0.05)。

表6 SARA對綿羊血清生化指標的影響

3 討 論

瘤胃pH受飼糧影響，一般情況下，反芻動物瘤胃pH維持在6.5～7.5[17]。瘤胃菌群變化與飼糧組成、飼養環境和管理模式等相關[18-19]。動物長期采食高精料飼糧，瘤胃異常發酵，導致瘤胃pH下降，瘤胃菌群改變[20]。Plaizier等[21]誘導奶牛SARA，發現瘤胃微生物區系豐富度和多樣性降低。眾多研究發現，反芻動物瘤胃最優菌門為擬桿菌門，最優菌屬為普雷沃氏菌屬[22-27]。李小玉等[27]研究急性瘤胃酸中毒山羊，發現瘤胃厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低。研究表明，SARA奶牛普雷沃氏菌屬相對豐度提升[28]，瘤胃壁菌群碳水化合物代謝相關基因高表達[29]。本研究與上述結果相似，瘤胃內酸性環境導致瘤胃菌群發生變化，大量瘤胃細菌因不適酸性環境而死亡，進而菌群豐富度和多樣性降低，造成瘤胃健康破壞和生產效能降低[30]。SARA模型組瘤胃厚壁菌門相對豐度增加，主要為降解纖維類物質和碳水化合物的菌種，進而引起菌群碳水化合物相關代謝基因富集，有助于反芻動物瘤胃代謝[24]。綿羊發生SARA后，瘤胃內毒素含量顯著升高，因擬桿菌門內革蘭氏陰性細菌大量死亡，擬桿菌門相對豐度降低，細菌裂解釋放內毒素[25]。羅氏菌屬相對豐度提升，瘤胃液乳酸含量顯著增加，表明SARA會增加瘤胃乳酸產生菌，導致瘤胃乳酸積累，pH下降。

SARA模型組血氣分析結果與胡紅蓮[14]和苑學[31]研究結果一致，血液pH、二氧化碳分壓、實際碳酸氫鹽和全血堿剩余含量降低，氧分壓含量升高。SARA綿羊血液乳酸含量顯著升高，表明瘤胃液乳酸吸收超過肝臟處理能力，導致血液pH下降，血液過多的氫離子(H+)由血液實際碳酸氫鹽緩沖，進而降低機體堿儲，發生代謝性酸中毒。SARA模型組瘤胃內毒素積累，促進炎癥介質組胺的產生，二者同時進入血液循環，血液與瘤胃液內毒素和組胺含量顯著升高，可能會引發一系列炎癥反應[32]。血清生化指標可以反映機體營養代謝狀況以及肝腎功能狀況。孫燕勇等[33]研究發現，SARA山羊有一定程度的肝功能損傷，本研究未發現肝臟損害，各項血清生化指標均處于正常范圍，可能與SARA持續時間有關。

4 結 論

本研究通過逐步遞增飼糧精粗比成功構建綿羊SARA模型。綿羊發生SARA時，瘤胃內環境改變，瘤胃菌群豐富度降低，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、普雷沃氏菌科未確定菌屬、羅氏菌屬和Pseudoscardovia相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度下降，血液和瘤胃液乳酸、內毒素和組胺含量升高，機體堿儲降低，發生代謝性酸中毒。

致謝：

感謝山西保森畜牧有限公司提供的試驗場地。