蛋氨酸對奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳蛋白和乳糖合成的調(diào)節(jié)作用

趙艷麗 閆素梅 郭曉宇 史彬林 陳 璐

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，呼和浩特 2010018)

乳腺組織的基本功能是產(chǎn)乳，為后代的生長和發(fā)育提供營養(yǎng)，牛奶的主要成分是乳蛋白、乳脂和乳糖[1]。乳蛋白是衡量牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是牛奶作為高營養(yǎng)食品的基本條件。乳糖是牛奶中的主要碳水化合物，是影響牛奶產(chǎn)量高低的決定因素。乳糖產(chǎn)量與乳產(chǎn)量呈高度的正相關(guān)[2-3]。必需氨基酸作為乳蛋白合成的重要前體物，可同時促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)內(nèi)乳蛋白和乳糖的合成[4]。蛋氨酸(Met)是乳蛋白合成的必需氨基酸，也是奶牛的第一限制性氨基酸。因此，深入探討Met對乳蛋白和乳糖合成的影響及其機(jī)理對提高產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)有重要意義。奶牛飼糧添加過瘤胃蛋氨酸可顯著提高產(chǎn)奶量、乳蛋白率[5]和乳糖含量[6]。體外研究發(fā)現(xiàn)，0.4 mmol/L的Met可以促進(jìn)BMECs內(nèi)乳蛋白合成和乳糖分泌[7]。可見Met調(diào)節(jié)乳蛋白合成的同時，對乳糖合成也有一定的影響。然而，前人的研究多偏重于Met對奶牛乳成分尤其是乳蛋白合成的影響效果，研究其對乳蛋白合成的影響機(jī)理較少，尤其對乳糖合成的影響機(jī)理探索則更少，有必要對此進(jìn)行深入研究。鑒于此，本研究以BMECs為模型，從基因和蛋白質(zhì)水平研究Met對乳蛋白和乳糖合成的影響，為深入研究Met對乳蛋白和乳糖合成的調(diào)節(jié)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用膠原酶消化法培養(yǎng)BMECs，具體參照Sheng等[8]的方法進(jìn)行，原代細(xì)胞貼壁率達(dá)約90%后進(jìn)行純化和傳代。試驗采用單因子隨機(jī)試驗設(shè)計，將第3代BMECs培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為6個組，每組6個重復(fù)。根據(jù)課題組前期的試驗結(jié)果[9]選取不同濃度的Met，分別為0.13(對照)、0.26、0.39、0.52、0.65和0.78 mmol/L，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中Met濃度為0.13 mmol/L，是王新朋[10]報道中奶牛動脈血中Met濃度的5倍。BMECs貼壁率為80%～90%時，無血清DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓12 h后每孔加入含不同濃度Met的培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，研究Met對BMECs內(nèi)乳蛋白和乳糖合成的影響機(jī)理。

1.2 測試指標(biāo)與方法

1.2.1 細(xì)胞活力的測定

細(xì)胞活力采用噻唑蘭(MTT)法測定[8]，用細(xì)胞相對增殖率(RGR)表示。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT(Amresco)，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞楓(DMSO)，振蕩10 min，使用全自動酶標(biāo)儀(Synergy H4，Bio-Tek)于490 nm波長下檢測培養(yǎng)孔的吸光值(OD)。

RGR(%)=(試驗組OD490/對照組OD490)×100。

1.2.2 乳糖含量的測定

BMECs培養(yǎng)液中乳糖含量采用酶聯(lián)免疫法，按照試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)說明書進(jìn)行測定。將細(xì)胞懸液以2×105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，按試驗設(shè)計培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，3 000×g離心20 min，收集上清。將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至1 200、800、400、200和100 μg/L，分別取50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)樣品孔內(nèi)。待測樣品孔內(nèi)加入40 μL稀釋液和10 μL待測樣品，37 ℃溫育30 min后清洗5次。加入酶標(biāo)試劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌5次；然后加入顯色劑A和B各50 μL，混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入50 μL終止液。使用全自動酶標(biāo)儀(Synergy H4，Bio-Tek)，450 nm波長下空白調(diào)零后，測定OD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乳糖的含量。

1.2.3 BMECs內(nèi)ATP含量

采用化學(xué)發(fā)光法測定BMECs內(nèi)的ATP含量[11]。BMECs于工作液培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL裂解液，4 ℃、15 455×g離心5 min，取上清備用。用檢測裂解液將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00和10.00 μmmol/L。將稀釋液和檢測試劑按照1∶9混合后作為工作液。最后孔內(nèi)加入100 μL工作液，室溫放置3 min后加入20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，使用酶標(biāo)儀(Synergy H4，Bio-Tek)測定閃光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中ATP的含量，以nmol/mg prot形式表示。

1.2.4 基因的表達(dá)和磷酸化水平的測定

總RNA提取采用Trizol法[11]，RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒并按說明書進(jìn)行。依據(jù)SYBY Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明書，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測乳蛋白和乳糖合成相關(guān)基因的表達(dá)，基因引物序列詳見表1。管家基因為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白(ACTB)。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 乳蛋白和乳糖合成相關(guān)基因的引物序列

采用Western Blotting法[11]測定哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)、真核起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、真核起始因子4E(eIF4E)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平。使用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。

磷酸化水平值=各組磷酸化灰度值/

對應(yīng)蛋白的灰度值。

mTOR、p-mTOR、eIF4E、p-eIF4E、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1抗體購自Abcam公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)通過Excel 2010進(jìn)行計算和整理，采用SAS 9.0分析軟件的方差分析(ANOVA)程序進(jìn)行顯著性檢驗。使用回歸統(tǒng)計程序進(jìn)行一次線性與二次曲線回歸分析。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 Met對BMECs的RGR、ATP和乳糖含量及相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

如表2可知，隨著Met濃度的增加，RGR呈一元二次增加的趨勢(P=0.062，R2=0.843 4)，其中，0.39～0.65 mmol/L組顯著高于0.13和0.78 mmol/L組(P<0.05)。ATP含量隨著Met濃度增加呈顯著的一元二次增加(P=0.027，R2=0.550 7)，以0.52 mmol/L組最高，0.78 mmol/L組最低。0.39 mmol/L組BMECs乳糖含量與0.65 mmol/L組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組(P<0.05)。

表2 Met對BMECs RGR、ATP和乳糖合成的影響

如圖1可知，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)和α-乳清白蛋白(LALBA)基因相對表達(dá)量隨Met濃度的增加呈顯著的一元二次下降(P=0.019，P=0.020；R2=0.930 0，R2=0.925 4)。GLUT1基因相對表達(dá)量以0.13和0.78 mmol/L組較高，顯著高于其他組(P<0.05)；LALBA基因相對表達(dá)量以0.39和0.52 mmol/L組較低，顯著低于其他組(P<0.05)。己糖激酶Ⅰ(HKⅠ)、己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)和β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1(β-4GALT1)基因相對表達(dá)量與Met濃度無顯著的劑量依賴關(guān)系(P>0.05)；但0.13和0.52 mmol/L組HKⅠ基因相對表達(dá)量有高于0.39 mmol/L組的趨勢(0.05

GLUT1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 glucose transporter 1；LALBA：α-乳清白蛋白 alpha-lactalbumin；HKⅠ：己糖激酶Ⅰ hexokinase Ⅰ；HKⅡ：己糖激酶Ⅱ hexokinase Ⅱ；β-4GALT1：β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1 β-1，4-galactosyltransferase-1。

2.2 Met對BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)和磷酸化水平的影響

如圖2所示，αS-1酪蛋白(CSN1S1)和κ-酪蛋白(CSN3)基因相對表達(dá)量隨Met濃度的增加呈顯著的一元二次增加(P<0.001，P=0.004，R2=0.978 8；R2=0.890 4)，CSN3基因相對表達(dá)量以0.52 mmol/L組最高，0.78 mmol/L組最低；β-酪蛋白(CSN2)基因相對表達(dá)量與Met濃度無顯著的回歸關(guān)系(P>0.05)，但0.52 mmol/L組顯著高于其他組(P<0.05)。酪氨酸激酶2(JACK2)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子5(STAT5)基因相對表達(dá)量隨Met濃度的增加呈顯著的一元二次增加(P=0.001，P<0.001；R2=0.947 9，R2=0.977 2)，0.52 mmol/L組JACK2基因表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)；0.39～0.52 mmol/L組STAT5基因相對表達(dá)量顯著高于其他組(P<0.05)，其他組間差異不顯著(P>0.05)。

CSN1S1：αS-1酪蛋白 αS1-casein；CSN3：κ-酪蛋白 κ-casein；CSN2：β-酪蛋白 β-casein；JACK2：酪氨酸激酶2 Janus kinase 2；STAT5：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子5 signal transducer and activator of transcription 5。

如圖3所示，mTOR、eIF4E和4EBP1基因相對表達(dá)量隨Met濃度的增加呈顯著的一元二次增加(P=0.006，P<0.001，P=0.020；R2=0.868 4，R2=0.961 0，R2=0.792 8)，mTOR基因相對表達(dá)量以0.26～0.52 mmol/L組較高，0.65～0.78 mmol/L組較低；eIF4E基因相對表達(dá)量0.39～0.52 mmol/L組顯著高于0.13 mmol/L組(P<0.05)。S6K1基因相對表達(dá)量隨Met濃度增加呈顯著的一次線性增加(P=0.038，R2=0.675 6)，0.26～0.78 mmol/L組有高于0.13 mmol/L組的趨勢(0.05

mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；S6K1：核糖體蛋白S6激酶1 ribosomal protein S6 kinase beta 1；4EBP1：真核起始因子4E結(jié)合蛋白1 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1；eIF4E：真核起始因子4E eukaryotic translation initiation factor 4E；AMPKα1：腺苷酸活化蛋白激酶α 1 AMP-activated protein kinase α1。下圖同 the same as below。

如圖4所示，mTOR、S6K1、eIF4E和AMPK磷酸化水平隨Met濃度的增加呈顯著的一元二次增加(P=0.001，P=0.001，P=0.003，P=0.002；R2=0.607 3，R2=0.649 6，R2=0.544 1，R2=0.571 1)，mTOR磷酸化水平0.39～0.78 mmol/L組顯著高于0.13和0.26 mmol/L組(P<0.05)；S6K1磷酸化水平以0.52 mmol/L組最高，0.26～0.52 mmol/L組eIF4E 磷酸化水平顯著高于其他組(P<0.05)，尤以0.39 mmol/L 組最高；AMPK磷酸化水平以0.52 mmol/L組最低，0.78 mmol/L組最高，顯著高于其他組(P<0.05)。Met濃度對4EBP1磷酸化水平影響不顯著(P>0.05)。

圖4 Met對BMECs內(nèi)mTOR信號通路磷酸化水平的影響

3 討 論

3.1 Met對BMECs內(nèi)乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)及磷酸化水平的影響

氨基酸作為細(xì)胞生長的營養(yǎng)素，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。適宜濃度的氨基酸與細(xì)胞的增殖存在時間和濃度的最優(yōu)化效應(yīng)，若低于或高于該值，增殖率就相應(yīng)下降[12]，常晨城[9]研究指出，0.52 mmol/L的Met提高細(xì)胞增殖率。乳蛋白的合成很大程度上受細(xì)胞增殖的影響，祁昊等[13]發(fā)現(xiàn)Met可通過激活mTOR信號通路促進(jìn)BMECs的增殖。本研究得出相似的結(jié)果，0.39～0.52 mmol/L 組細(xì)胞增殖率和mTOR磷酸化水平較高，0.78 mmol/L組均較低，說明適宜濃度Met促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度反而有抑制作用。

Met是蛋白質(zhì)合成的第一限制性氨基酸，Nan等[14]發(fā)現(xiàn)，與無氨基酸組相比，0.5 mmol/L Met顯著促進(jìn)BMECs內(nèi)CSN1S1和CSN3的基因表達(dá)，但對CSN3基因表達(dá)影響不顯著。常晨城[9]指出，與0.13 mmol/L Met組相比，0.52 mmol/L Met顯著上調(diào)BMECs內(nèi)CSN1S1和CSN3的基因表達(dá)量，但不影響CSN2的基因表達(dá)量。本研究結(jié)果表明，Met對于酪蛋白的合成調(diào)控有顯著的作用，0.52 mmol/L的Met顯著上調(diào)CSN1S1和CSN3的基因相對表達(dá)量，但0.78 mmol/L的Met抑制其表達(dá)。JACK2/STAT5和mTOR信號通路是參與乳蛋白調(diào)控的2條重要通路。BMECs內(nèi)生長激素可以通過激活STAT5調(diào)控CSN1S1、CSN1S2和CSN2 mRNA表達(dá)[15]。與無Met組相比，0.5 mmol/L的Met顯著上調(diào)BMECs內(nèi)JACK2和STAT5基因表達(dá)[14]，JACK2/STAT5信號通路是Met促進(jìn)酪蛋白合成的重要途徑[16]。本研究中，0.39～0.52 mmol/L Met對JACK2和STAT5基因相對表達(dá)量有較好的促進(jìn)效果，因此，Met通過JACK2/STAT5通路在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控乳蛋白合成。

mTOR通路及下游元件共同參與氨基酸調(diào)控乳蛋白的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，與氨基酸組相比，0.5 mmol/L的Met對BMECs內(nèi)mTOR和S6K1基因表達(dá)均無顯著的促進(jìn)作用，但mTOR磷酸化水平顯著增加，Met對蛋白合成的影響主要在轉(zhuǎn)錄后的翻譯階段[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR、eIF4E、4EBP1和S6K1基因相對表達(dá)量及mTOR和S6K1磷酸化水平與Met濃度呈劑量依賴關(guān)系，以0.39～0.52 mmol/L組較高，0.78 mmol/L抑制mTOR的表達(dá)和磷酸化水平，說明適宜濃度的Met通過激活mTOR信號通路促進(jìn)酪蛋白合成。mTOR信號通路上游的元件AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量的主要調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)能量的供應(yīng)與需求的平衡[17]，其活性與mTOR介導(dǎo)的合成代謝信號通路呈負(fù)相關(guān)[18]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降和AMP含量增加時AMPK被激活，抑制ATP的消耗[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.26～0.65 mmol/L組ATP含量較高，AMPK磷酸化水平較低，mTOR基因相對表達(dá)量和磷酸化水平和酪蛋白基因表達(dá)較高；相反高濃度Met組ATP含量較低，AMPK磷酸化水平較高，mTOR磷酸化水平和酪蛋白基因表達(dá)下降，說明適宜濃度的Met可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ATP含量抑制AMPK磷酸化水平，進(jìn)而激活mTOR信號通路促進(jìn)乳蛋白的合成。

3.2 Met對BMECs內(nèi)乳糖合成及相關(guān)基因表達(dá)的影響

葡萄糖是乳糖合成的主要前體物，由于乳腺內(nèi)缺少葡萄糖-6-磷酸酶，不能通過糖異生合成葡萄糖[20]。所以，在體外研究中，乳腺內(nèi)氨基酸對乳糖合成的影響只能通過調(diào)控作用來完成。血液中總葡萄糖的60%～85%被乳腺吸收[21]。所以，乳腺對葡萄糖的吸收是控制乳產(chǎn)量的限速步驟。GLUT是牛乳腺中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，牛乳腺中主要表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT1，泌乳期其表達(dá)上調(diào)幾百倍[22]。GLUT1表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致葡萄糖用于合成乳糖的利用率降低[23]。雞和大鼠的胸腺中，隨著葡萄糖利用率增加，GLUT1 mRNA的表達(dá)也增加[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.26～0.65 mmol/L組GLUT1基因相對表達(dá)量較低，提示0.26～0.65 mmol/L的Met抑制細(xì)胞對葡萄糖的攝取。乳糖合成酶是由β-4GALT1與LALBA構(gòu)成的二聚體，是乳糖合成和分泌的限速酶。有研究指出，奶牛飼糧添加過瘤胃蛋氨酸對血漿葡萄糖含量影響不顯著[25]，乳糖含量的變化也較小[26]。但體外研究發(fā)現(xiàn)，0.4 mmol/L的Met組BMECs乳糖含量顯著高于0.2 mmol/L組[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，0.39 mmol/L組乳糖含量高于其他組。但0.26～0.52 mmol/L的Met抑制葡萄糖的攝取和乳糖合成酶LALBA基因相對表達(dá)量，這可能與β-4GALT1基因相對表達(dá)量增加有關(guān)。但目前，關(guān)于Met對乳糖合成的影響研究較少，確切的機(jī)理尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究探討。

綜合以上結(jié)果，Met濃度為0.39～0.52 mmol/L時對BMECs內(nèi)乳蛋白和乳糖合成的促進(jìn)效果較好。目前已有研究證實(shí)了體外細(xì)胞培養(yǎng)液的氨基酸濃度與血液氨基酸濃度有一定關(guān)系，Appuhamy等[18]研究中BMECs細(xì)胞培養(yǎng)液的氨基酸濃度大于奶牛血液氨基酸濃度。本研究中細(xì)胞培養(yǎng)液Met的最低濃度約為Rius等[27]和王新朋[10]報道的奶牛動脈血中Met濃度的5倍。在實(shí)際生產(chǎn)中，NRC(2001)推薦泌乳奶牛Met的供給量應(yīng)占飼糧代謝蛋白質(zhì)的2.4%，且有關(guān)奶牛飼糧添加Met的研究多側(cè)重于研究乳成分含量的變化，而針對影響機(jī)理的研究較少，因此，本研究利用體外法得出的結(jié)果還需要在體內(nèi)進(jìn)一步驗證。

4 結(jié) 論

Met對CSN1S1和CSN3基因表達(dá)的促進(jìn)作用呈劑量依賴關(guān)系，以0.52 mmol/L組表達(dá)較好，0.78 mmol/L組抑制其表達(dá)；0.39～0.52 mmol/L組對JACK2/STAT5、mTOR通路相關(guān)基因的表達(dá)、mTOR和S6K1的磷酸化水平及ATP含量促進(jìn)效果較好，但抑制AMPK的磷酸化水平。Met對GLUT1和LALBA基因表達(dá)的抑制作用呈顯著的劑量依賴關(guān)系，0.52～0.65 mmol/L組的抑制作用較弱，但乳糖含量以0.39 mmol/L組最高。綜合以上指標(biāo)，Met濃度為0.39～0.52 mmol/L時對乳蛋白和乳糖合成的促進(jìn)效果較好。