改性蒙脫石對斷奶仔豬生長性能、血清免疫和抗氧化功能及豬腸上皮細胞的影響

詹小立 應加富 鄧 波 吳 杰 李靜靜 劉宇宸 余東游 李衛芬* 徐子偉*

(1.浙江大學動物科學學院，杭州 2310021；2.浙江豐虹生物科技有限公司，湖州 2313300；3.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所，杭州 2310021)

斷奶可以引起仔豬氧化應激及腸道損傷[1]，并影響其免疫功能，最終導致其腹瀉以及生長受阻[2-3]。在過去的幾十年中，抗生素、氧化鋅和硫酸銅已被廣泛應用于養豬業，以提高免疫力，減少仔豬腹瀉[4]。然而，這些添加劑的濫用也導致了抗生素耐藥性以及重金屬殘留等問題，使用安全的飼料添加劑是大勢所趨[5]。

蒙脫石是一種含水鋁硅酸鹽的層狀礦物(為膨潤土的主成分)，其單位晶胞由2層硅氧四面體片和1層鋁氧八面體片組成，屬于典型2∶1“三明治”結構，晶體結構內存在大量1 nm左右的微孔或通道，大大增加了其比表面積。在晶體構造層間含有水及可交換的陽離子——鈉離子(Na+)、鉀離子(K+)、鈣離子(Ca2+)和氫離子(H+)等[6]。蒙脫石可減少霉菌毒素污染，具有防治腸道疾病及提高動物生產性能等功效[7-9]。通過陽離子交換法可使銅離子(Cu2+)替代蒙脫石中原有的陽離子，從而改變蒙脫石的結構[改性蒙脫石(modified montmorillonite，MMT)]，使其具有更大的層間距和比表面積，形成新的二維微孔蒙脫石材料。本試驗旨在研究飼糧添加MMT對斷奶仔豬生長性能、血清免疫和抗氧化功能的影響，同時通過體外細胞試驗研究其對豬腸上皮細胞抗炎及凋亡的影響，為MMT在仔豬養殖中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MMT由浙江某生物科技有限公司提供，制備方法如下：將膨潤土分散于水中制備濃度5%～10%的膨潤土漿液，攪拌浸泡3～5 h，加入鈉化改性劑，50～70 ℃恒溫攪拌反應5～8 h，提純、脫水、洗滌、烘干，得到高純蒙脫石。取上述高純蒙脫石樣品，加入質量比20倍的雙蒸水，攪拌成懸浮液，按摩爾比1.5倍離子交換容量的量加入Cu2+(CuSO4·5H2O，分析純)，攪拌24 h，過濾后用雙蒸水洗滌3次，真空干燥，研磨至過600目篩，得到載銅蒙脫石樣品，MMT的銅離子交換容量>1 100 mmol/kg。

1.2 仔豬養殖試驗

選取48頭體重為(7.42±0.85) kg的24日齡斷奶仔豬隨機分成2個組，每組4個重復，每個重復6頭豬(公母各占1/2)。對照組飼喂基礎飼糧，基礎飼糧為參照NRC(2012)斷奶仔豬營養需要配制的粉狀配合飼料，其組成及營養水平見表1；MMT組飼喂基礎飼糧+1.6‰ MMT。試驗期28 d，試驗期間豬自由采食和飲水，常規驅蟲和免疫。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items第1～14天 Days 1 to 14第15～28天 Days 15 to 28消化能 DE/(MJ/kg)13.8513.68賴氨酸 Lys1.271.18蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.740.72蘇氨酸 Thr0.900.82鈣 Ca0.800.70總磷 TP0.650.60

1.3 生長性能指標測定

分別于試驗第1天、第14天和第28天對仔豬空腹稱重，并記錄各欄采食量。計算各階段仔豬平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每天早晚2次記錄仔豬腹瀉次數，計算每欄腹瀉率：

每欄腹瀉率=每欄全期腹瀉次數/

(每欄觀察總頭次數×試驗天數)。

1.4 血清樣品的制備及生化指標的測定

試驗結束時，每欄選取2頭仔豬(公母各1頭)前腔靜脈采血，靜置8 h待血清析出，3 000 r/min離心10 min，將上清分裝于離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存待測。

血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)含量以及二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)等指標的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，測定方法按照說明書進行。

1.5 體外細胞試驗

體外細胞試驗主要用到的試劑：DMEM/F12高糖培養基、青霉素/鏈霉素雙抗(100×)購自上海源培生物科技有限公司，0.25%胰酶[含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]購自索萊寶公司，胎牛血清(FBS)購自Gibico公司，LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。

細胞培養方法如下：將凍存的IPEC-J2細胞從液氮中取出，在37 ℃水浴鍋內快速解凍，并將配制好含有10%FBS的DMEM/F12完全培養基(含1%青霉素/鏈霉素雙抗)從4 ℃冰箱取出預熱。將融化后的細胞加到含有一定量預熱的培養基離心管內，1 000 r/min離心5 min后將沉淀接種于10 cm的培養皿內，放置在37 ℃、CO2濃度為5%、相對濕度為100%的恒溫培養箱。待細胞長滿70%～80%時，去掉上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，加入1 mL的胰酶消化2 min后，加入2 mL完全培養基終止消化，吹打細胞收集懸液于10 mL離心管內，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入DMEM/F12完全培養基，再根據試驗計劃將細胞接種或是鋪板。

MMT對IPEC-J2活性的影響：IPEC-J2細胞消化后按一定數目接種到96孔板中，當細胞匯合度達到70%～80%時加入梯度濃度(1×10-5～1 mg/mL)的MMT，每個濃度做6個重復，作用12 h后加入含有10%八肽膽囊收縮素(CCK-8)的溶液(碧云天)100 μL，繼續放入恒溫培養箱孵育2.5 h，在酶標儀(Biotek)450 nm波長處檢測各孔的吸光度，計算各濃度活性差異。MMT對IPEC-J2細胞毒性的影響：先消化細胞計數，按一定濃度的細胞量鋪入12孔板中，待細胞貼壁達到一定匯合度后加入不同濃度的MMT繼續作用24 h后取上清測定乳酸鹽脫氫酶(LDH)的活性(LDH檢測試劑盒，碧云天)。劃痕試驗類似，先鋪成12孔板后進行物理劃痕，按照0.01 mg/mL MMT處理細胞，量取0 h寬度，繼續培養24 h后對細胞再量取劃痕寬度，計算相對愈合程度。

1.6 MMT對IPEC-J2細胞基因表達量的影響

先將消化后的細胞按照一定的量鋪入6孔板，待細胞長滿后分別加入PBS、LPS、MMT和MMT預處理12 h后再加入LPS作用12 h，收集細胞，提取總RNA，利用熒光定量PCR儀器(Bio-Rad)測定炎癥因子基因、凋亡基因和緊密連接蛋白基因的表達水平。引物序列見表2。

表2 引物序列

續表2基因 Genes登錄號 Accession No.引物序列 Primer sequences (5'—3')封閉蛋白-1 Claudin-1NM_001244539.1F：AGGACTACGTATGAGGGGGR：GACTGGTCTCGGATGCAAG胱天蛋白酶-3 Caspase-3NM_214131.1F：GAATGGGGGGAGAGACACCTR：CCGCCACTCGGAAAAAGA胱天蛋白酶-8 Caspase-8XM_021074713.1F：CAGCCTCAGGAATCAGGACGTGR：TGTAGTTGTAACCGTGGCAGCB細胞淋巴瘤2相關X蛋白 BAXXM_013998624.2F：GAATGGGGGGAGAGACACCTR：CCGCCACTCGGAAAAAGAB細胞淋巴瘤2 BCL2XM_021099593.1F：TGATTTCTCCTGGCTGTCTCR：GCCCGTCCACTTCACTTAT

1.7 數據處理與統計方法

試驗數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為有變化趨勢。腹瀉率進行卡方檢驗，血清生化指標及體外試驗采用獨立樣本t檢驗進行統計分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 MMT對斷奶仔豬生長性能及腹瀉率的影響

由表3可知，與對照組相比，MMT組斷奶仔豬第14天體重有增加趨勢(0.05≤P<0.10)，第28天體重顯著增加(P<0.05)，平均體重達到(13.59±1.30) kg；MMT組斷奶仔豬全期(第1～28天)ADG也顯著增加(P<0.05)，第1～14天和第1～28天ADFI略有升高(P>0.05)，第15～28天ADFI顯著增加(P<0.05)；同時，MMT組斷奶仔豬第1～14天F/G顯著降低(P<0.05)。試驗期間各組仔豬腹瀉率均不較高，與對照組相比，MMT組斷奶仔豬腹瀉率顯著降低(P<0.05)。

續表3項目 Items對照組 Control groupMMT組 MMT group第15～28天 Days 15 to 282.05±0.462.05±0.15第1～28天 Days 1 to 281.92±0.111.89±0.08腹瀉率 Diarrhea rate/%第1～14天 Days 1 to 145.32±0.52a3.30±0.52b第15～28天 Days 15 to 2814.90±0.73a5.90±0.67b第1～28天 Days 1 to 2810.11±0.17a4.60±0.14b

2.2 MMT對斷奶仔豬血清抗氧化功能的影響

由圖1可知，與對照組相比，MMT組斷奶仔豬血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，血清CAT活性有升高趨勢(0.05≤P<0.10)，這說明飼糧添加MMT可有效提高斷奶仔豬血清抗氧化功能，降低氧化應激。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下圖同。

2.3 MMT對斷奶仔豬血清免疫功能的影響

由圖2可知，與對照組相比，MMT組斷奶仔豬血清DAO活性及IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，血清MPO活性和LPS含量有降低的趨勢(0.05≤P<0.10)，血清IgG、IgA和IgM含量無顯著差異(P>0.05)，這說明飼糧添加MMT可顯著降低斷奶仔豬血清的炎癥反應。

圖2 MMT對斷奶仔豬血清免疫功能的影響

2.4 MMT對斷奶仔豬腸上皮細胞活性、緊密連接和炎癥損傷的影響

由圖3可知，CCK-8法和LDH活性檢測結果發現，0.01 mg/mL MMT對IPEC-J2細胞LDH活性無顯著影響(P>0.05)，但0.1 mg/mL MMT可極顯著提高IPEC-J2細胞LDH活性(P<0.01)，說明0.01 mg/mL MMT對細胞無毒性，后續試驗按此濃度進行。

圖3 MMT對斷奶仔豬腸上皮細胞活性的影響

由圖4可知，炎癥相關基因測定結果表明，與對照相比，MMT處理可顯著提高斷奶仔豬腸上皮細胞白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)表達水平(P<0.05)，但對IL-6、白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和TNF-α表達水平無顯著影響(P>0.05)；LPS處理使得斷奶仔豬腸上皮細胞IL-8、IL-1α和TNF-α表達水平極顯著升高(P<0.01)，MMT預處理(MMT+LPS)可使抗炎因子——轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)(P<0.01)和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators activate receptor γ，PPARγ)及促炎因子——IL-1α、IL-8和TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.05)，而IL-6表達水平極顯著降低(P<0.01)，這說明MMT可同時調節細胞促炎和抗炎反應，緩解LPS引起的炎癥反應。

圖4 MMT對斷奶仔豬腸上皮細胞細胞因子基因表達的影響

利用劃痕試驗建立IPEC-J2損傷模型，結果表明低濃度MMT(5 μg/mL)可顯著促進細胞損傷修復(P<0.05)，而10 μg/mL MMT對細胞損傷修復無顯著影響(圖5)。此外，與對照相比，LPS處理可極顯著提高凋亡基因——B細胞淋巴瘤2相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，BAX)的表達水平(P<0.01)，MMT處理可極顯著降低凋亡基因——胱天蛋白酶-3(caspase-3)、胱天蛋白酶-8(caspase-8)和抗凋亡基因——B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，BCL2)的表達水平(P<0.01)，而MMT預處理后再用LPS處理可極顯著提高caspase-3和BCL2的表達水平(P<0.01)。另外，與對照相比，LPS處理可極顯著顯著降低緊密連接基因——封閉蛋白-1(claudin-1)、閉合蛋白(occludin)和緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)的表達水平(P<0.01)，造成了腸道損傷，而MMT可極顯著降低claudin-1和occludin的表達水平(P<0.01)，MMT預處理極顯著提高claudin-1、occludin和ZO-1的表達水平(P<0.01)。因此，MMT預處理可顯著提高細胞抗凋亡功能，有效預防腸上皮細胞的損傷。

圖5 MMT對斷奶仔豬腸上皮細胞損傷修復、細胞凋亡和抗炎因子表達的影響

3 討 論

仔豬斷奶應激表現為生長阻滯和腹瀉等現象，眾多研究和生產經驗都證實飼糧中添加高劑量的鋅能有效控制仔豬腹瀉，但高劑量的鋅會破壞各種微量元素的平衡，影響仔豬對銅和鐵的吸收，導致鐵和銅繼發性缺乏，出現貧血[10]；此外，飼糧中的大部分鋅將隨糞便排泄到環境中，造成環境污染。

蒙脫石作為非營養性添加劑已應用到動物養殖中以改善其生產性能[10]。蒙脫石具有吸附陽離子的特性，對消化道內的霉菌毒素、病毒、致病菌及其產生的毒素有固定和吸附的作用，并能夠保護和修復腸道黏膜。此外，蒙脫石不會進入機體的血液循環，在腸道內連同所固定的因子隨消化道蠕動排出體外，不改變糞便的顏色及腸道正常的蠕動功能[11]。蒙脫石中還含有豐富的銅、鋅、鈷和硒等微量元素，可彌補微量元素的不足，對畜禽的生長有促進作用[11]。Venglovski等[12]和Prasai等[13]研究報道，含有蒙脫石(1.0%～2.0%)的飼糧可以促進雞和豬的ADG和飼料轉化率。郭彤等[14]研究報道，斷奶仔豬飼糧中添加納米載銅蒙脫石能顯著提高斷奶仔豬的ADG和飼料轉化率，顯著降低仔豬腹瀉率及小腸和結腸內容物中大腸桿菌和沙門氏菌的數量，并且高劑量(2 000 mg/kg)的納米載銅蒙脫石對生長性能無顯著影響。武力等[15]研究報道，添加納米蒙脫石對斷奶仔豬生長性能無顯著影響，但對ADFI有提高趨勢。陳大水等[10]研究報道，在飼糧中添加不同水平的納米蒙脫石，隨著添加水平的提高，仔豬ADFI和ADG均呈遞增的趨勢。Tang等[16]在仔豬飼糧中補充硅鋁酸鹽黏土礦，發現能顯著改善仔豬的生長性能，提高營養物質消化率，從而顯著提高仔豬的ADG。本試驗結果表明，飼糧添加MMT可顯著改善斷奶仔豬生長性能，與大多數研究報道一致。

在引起仔豬腹瀉的諸多因素中，原發性因素并不是大腸桿菌等致病菌，而是由于斷奶應激(尤其是采食了大量的植物性蛋白質飼料)破壞了腸道菌群平衡和黏膜結構，造成腸道損傷(小腸絨毛變短)和胃腸道酶活性降低，消化吸收功能下降，食糜以腹瀉形式排出[17]。李輝等[18]研究報道，納米蒙脫石對消化道黏膜有覆蓋能力，并通過與黏液糖蛋白相互結合，修復和提高胃腸黏膜對致病因子的防御功能，對禽畜類腹瀉、痢疾等疾病預防和治療有獨特的效果[19]。謝長青等[20]采用納米蒙脫石替代抗生素對仔豬腹瀉進行治療，取得了良好的效果，同時，其他研究報道也證實納米蒙脫石對控制仔豬腹瀉具有良好的作用[21-22]。

蒙脫石因具有不飽和負電荷和陽離子交換能力，可以捕獲、吸附和固定毒素，降低腸道對毒素的吸收及其毒害作用[23]。斷奶會引發仔豬CD4+、CD8+等T細胞亞群的釋放及腸道炎性因子基因的表達，炎癥的發生會進一步損害腸道上皮細胞，破壞腸道黏膜屏障功能[24]。Shi等[25]通過在肉仔雞飼糧中添加3.0 g/kg的納基改性蒙脫石，顯著緩解了黃曲霉毒素對肉仔雞生長性能、免疫機能和血清生化指標的影響，緩解了飼糧中霉變花生粕對肉仔雞造成的生長抑制和免疫器官腫大。在霉變的飼糧中添加2.0 g/kg的蒙脫石，顯著提高了肉鴨ADG、ADFI及血漿蛋白含量，顯著抑制免疫器官指數的升高[26]。本研究結果，斷奶仔豬飼糧中添加MMT可顯著降低血清炎性因子——TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，這與陳鵬等[27]在保育仔豬上的研究結果一致；另外，馬元山等[28]在育肥豬飼糧中添加蒙脫石可提高機體的抗氧化能力，本試驗結果發現MMT組斷奶仔豬血清MDA含量顯著降低，血清T-AOC有上升趨勢，說明MMT具有緩解氧化應激的效果。

體外豬腸上皮細胞試驗發現，MMT可顯著降低炎癥因子IL-6的表達水平，而且MMT預處理后可有效緩解LPS引起的炎癥，顯著提高抗炎因子TGF-β和PPARγ的表達水平，提示MMT有緩解炎癥引起損傷的效果，這與體內血清檢測結果相一致。MMT具有促進劃痕愈合速度，同時顯著提高緊密連接基因的表達和細胞抗凋亡功能，提示MMT可促進腸上皮細胞的損傷修復，這與Jiao等[29]和徐軍等[30]研究蒙脫石的損傷修復機制一致，蒙脫石能夠減輕LPS帶來的腸道損傷。此外，本試驗結果表明，MMT處理可以顯著降低腸上皮細胞凋亡基因caspase-3、caspase-8和BCL2的表達水平，提示MMT可能具有抗凋亡的效果；本試驗還表明，0.01 mg/mL MTT對細胞是安全的，因其直接接觸細胞，所以作用濃度低于飼糧中的添加量(飼糧中的添加量相當于1.6 mg/g)。

4 結 論

① 飼糧添加1.6‰的改性蒙脫石可通過提高斷奶仔豬血清抗氧化功能和腸道黏膜屏障功能，降低體內炎癥反應，從而促進生長、降低腹瀉。

② 體外細胞試驗驗證MTT(0.01 mg/mL)能提高豬腸上皮細胞抗炎、抗凋亡和損傷修復功能。