右旋糖酐酶酶學(xué)特性及熱失活動(dòng)力學(xué)研究

常國煒，黎志德，黃曾慰，柳穎，劉桂云，梁達(dá)奉，張九花

(廣東省科學(xué)院生物工程研究所 中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心 廣東省酶制劑與生物催化工程技術(shù)研究中心，廣州 510316)

右旋糖酐酶(dextranase，EC3.2.1.11)是收錄在GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的食品用酶制劑[1]，專一催化內(nèi)切水解右旋糖酐的α-1，6-糖苷鍵[2]。近期有關(guān)右旋糖酐酶的研究熱點(diǎn)是其與右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase，EC2.4.1.5)的聯(lián)合應(yīng)用，包括共固定化[3-4]和甜味劑在內(nèi)的物質(zhì)合成等[5-7]。在實(shí)際應(yīng)用中，最主要的應(yīng)用場(chǎng)景是制糖行業(yè)。制糖行業(yè)(包括甘蔗制糖、甜菜制糖、精煉糖)飽受葡聚糖問題(制糖行業(yè)所說的葡聚糖指的是右旋糖酐)影響[8-10]，而右旋糖酐酶正好能水解右旋糖酐，消除葡聚糖對(duì)制糖過程的不良影響[11-13]。酶制劑的使用與其他食品添加劑有所不同，因?yàn)槊钢苿┚哂忻傅奶匦?，雖然高效、專一，但需要在較窄的合適條件進(jìn)行酶促反應(yīng)，在其他條件下會(huì)降低活性，甚至完全失活失效；酶制劑的添加量也要根據(jù)底物的濃度和實(shí)際工藝進(jìn)行調(diào)整，盲目地提高添加量不一定能得到更好的效果。所以，使用酶制劑前需對(duì)其酶學(xué)特性有清晰了解，再結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工藝和環(huán)境，才能制定合理的使用方案，使酶制劑更好地發(fā)揮作用。本研究對(duì)廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)研發(fā)的右旋糖酐酶最適條件進(jìn)行確定，研究常見食品添加劑對(duì)其酶活的影響，以及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為制糖行業(yè)和其他行業(yè)應(yīng)用該酶提供較詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

右旋糖酐酶：基因來源于某毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)微生物(具體基因序列未公開發(fā)表)，由廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)提供；Dextran fromLeuconostocmesenteroides(平均摩爾質(zhì)量1500000～2800000，下稱T-2150)：經(jīng)凝膠滲透色譜法[14]確定其數(shù)均分子量為230000 dal，美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、無水硫酸鈉、疊氮鈉、蔗糖、磷酸、無水乙醇、苯甲酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈣：均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

HB43-S鹵素水分測(cè)定儀、AL104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；pH 610臺(tái)式酸度計(jì) 德國Wiggens公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DTL21B電陶爐 合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司；2800紫外可見光分光光度計(jì) 美國UNIC公司；DF-Ⅱ集熱式磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀(配置CTO-20AC柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、RID-10A示差折光檢測(cè)器、CBM-20A系統(tǒng)控制器) 日本Shimadzu公司；Shodex OHpak SB-806M HQ高效液相色譜填充柱 日本昭和電工株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 右旋糖酐酶活力測(cè)定

采用1.0 mL反應(yīng)體系。底物溶液是用一定濃度和pH的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液溶解T-2150至濃度為20 g/L。取0.95 mL底物溶液在反應(yīng)溫度下保溫5 min，加入0.05 mL稀釋一定倍數(shù)的右旋糖酐酶溶液，繼續(xù)在該溫度反應(yīng)3 min后，加入2 mL DNS溶液(配制方法見參考文獻(xiàn)[15])，沸水浴5 min后，用蒸餾水定容到10 mL，測(cè)定試驗(yàn)組的OD540。平行測(cè)定3次，取平均值表示最終酶活力。以加入滅活酶溶液的試驗(yàn)組做空白。酶活力單位(U)定義為：在最適反應(yīng)條件(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液)下，反應(yīng)3 min，每分鐘催化右旋糖酐(平均分子量2150000 dal)生成1 μmol還原端(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量為一個(gè)活力單位。

1.3.2 右旋糖酐酶最適溫度

固定pH為5.5、緩沖液濃度為0.05 mol/L，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度分別為50，55，60，65，70 ℃，按1.3.1的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 右旋糖酐酶最適pH

固定緩沖液濃度為0.05 mol/L，配制pH分別為5.0，5.5，6.0，6.5的底物溶液，固定反應(yīng)溫度為60 ℃，按1.3.1進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 右旋糖酐酶最適離子強(qiáng)度

固定pH為5.5，配制緩沖液濃度分別為0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.07，0.09 mol/L的底物溶液，固定反應(yīng)溫度為60 ℃，按1.3.1的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5 右旋糖酐酶在堿性、乙醇條件下的穩(wěn)定性

取適量酶液，稀釋至一定倍數(shù)并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，8.5，9.5，在室溫下靜置30 min后，按1.3.1在最適條件下測(cè)定酶活力。

添加5%、10%、15%、30%(V/V)無水乙醇至蒸餾水中配制成乙醇溶液，用該乙醇溶液稀釋酶液，在室溫下靜置30 min后，按1.3.1的方法在最適條件下測(cè)定酶活力。

1.3.6 食品添加劑對(duì)右旋糖酐酶的影響

取最適條件的底物溶液，分別內(nèi)含苯甲酸鈉、Na2SO3、Na2-EDTA、CaCl2且溶液中各物質(zhì)濃度為2 mmol/L，按1.3.1的方法在最適條件下測(cè)定酶活力。

1.3.7 右旋糖酐酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別取T2150濃度為4，8，12，16，20 g/L的最適底物溶液，按1.3.1的方法進(jìn)行操作，5個(gè)濃度試驗(yàn)的酶液稀釋倍數(shù)需要一致。計(jì)算出葡萄糖量后，換算成反應(yīng)速度，運(yùn)用Haldance方程(方程1)和變式(方程2)可做出Hanes-Woolf圖，通過一元線性回歸分析估計(jì)測(cè)定右旋糖酐酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和vmax。

(1)

(2)

式中：v為反應(yīng)速率，μmol/min；vmax為最大反應(yīng)速率，μmol/min；[S]為底物濃度，mol/L；Km為米氏常數(shù)，mol/L。

1.3.8 右旋糖酐酶的熱失活動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

將酶液和含200 g/L蔗糖的酶液于60 ℃水浴分別保溫0～5 min，取出迅速放入冰浴中冷卻。按1.3.1的方法以最適條件測(cè)定酶活力。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力(方程 3)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，得到熱處理時(shí)間對(duì)右旋糖酐酶活性的影響曲線，以此曲線為基礎(chǔ)，研究右旋糖酐酶在不同條件下的熱失活動(dòng)力學(xué)。

(3)

式中：At為熱處理時(shí)間為t的樣品酶活，U/mL；A0為熱處理時(shí)間為0 min的樣品酶活，U/mL；t為熱處理時(shí)間，min。

1.3.9 熱失活速率常數(shù)K、半衰期T1/2和D值的計(jì)算

描述酶耐熱性的重要參數(shù)有：半衰期T1/2、D值。其中半衰期T1/2和10倍減少時(shí)間D值是用來描述酶穩(wěn)定性的重要參數(shù)。半衰期越大，酶的熱穩(wěn)定效果越好。D值是指在一定的熱力致死溫度條件下，目標(biāo)酶損失90%活力所需要的加熱時(shí)間(s)，D值越大表示該酶的耐熱性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

DNS溶液堿性和緩沖能力均強(qiáng)，針對(duì)本試驗(yàn)，不同反應(yīng)體系在加入DNS后均能獲得較一致的體系，不影響加熱反應(yīng)及后續(xù)測(cè)定。所以，不同反應(yīng)體系能用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用反應(yīng)后的數(shù)據(jù)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，可以看出，零點(diǎn)和另外5點(diǎn)明顯不在一條直線上，所以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)剔除零點(diǎn)，只用5個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其工作區(qū)間也相應(yīng)從第一點(diǎn)開始，工作范圍是0.024≤x≤0.484，R2=0.9975，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合程度良好，能用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 DNS法葡萄糖質(zhì)量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose mass-absorbance by DNS method

2.2 溫度對(duì)右旋糖酐酶活性的影響

由圖2可知，反應(yīng)溫度為60，65 ℃時(shí)，酶活力優(yōu)于其他溫度，但兩者較為接近。經(jīng)顯著性分析，表明60，65 ℃兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異(P>0.05)，說明在60，65 ℃下酶活力的表現(xiàn)相當(dāng)。在55～65 ℃范圍內(nèi)，酶分子能保持80%以上的反應(yīng)活性；達(dá)到70 ℃時(shí)，酶活性下降至40%左右。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響Fig.2 The effect of reaction temperature on enzyme activity

2.3 pH對(duì)右旋糖酐酶活性的影響

由圖3可知，pH為5.5時(shí)的酶活力最優(yōu)，在pH 5～6內(nèi)其活性仍能保持在80%以上。在另一個(gè)研究中，使用檸檬酸-Na2HPO4緩沖液、反應(yīng)溫度60 ℃和反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，得到了類似的結(jié)果。雖然反應(yīng)條件不同，但均能得出pH為5.5時(shí)反應(yīng)較優(yōu)，說明在該氫離子濃度下，酶蛋白的構(gòu)象情況確實(shí)有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，而且有機(jī)緩沖液和無機(jī)緩沖液在相同pH下對(duì)酶活的影響比較一致。

圖3 pH對(duì)酶活力的影響Fig.3 The effect of pH value on enzyme activity

2.4 離子強(qiáng)度對(duì)右旋糖酐酶活性的影響

由圖4可知，當(dāng)緩沖液濃度為0.015 mol/L時(shí)，酶活力最優(yōu)；當(dāng)緩沖液濃度在0.02～0.1 mol/L時(shí)，酶活力基本相同，且只有最優(yōu)時(shí)的77%左右。離子強(qiáng)度對(duì)該反應(yīng)體系的影響復(fù)雜。右旋糖酐和酶分子都是高分子，離子強(qiáng)度對(duì)高分子鏈的構(gòu)象有影響。對(duì)于右旋糖酐糖鏈，離子強(qiáng)度可能影響其均方旋轉(zhuǎn)半徑和分子鏈剛性度等性質(zhì)，即會(huì)影響糖鏈的延展程度，這會(huì)影響糖鏈和酶分子作用位點(diǎn)的結(jié)合，從而影響其反應(yīng)情況。對(duì)于酶分子，離子強(qiáng)度可能對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子表面疏水性等構(gòu)象問題有影響，從而影響其反應(yīng)情況。由于影響因素復(fù)雜，通過簡(jiǎn)單的試驗(yàn)難以解釋產(chǎn)生差異的具體原因。

圖4 離子強(qiáng)度對(duì)酶活力的影響Fig.4 The effect of ion strength on enzyme activity

2.5 右旋糖酐酶在堿性、乙醇條件下的穩(wěn)定性

由表1可知，右旋糖酐酶在高pH(最高至9.5)和高乙醇濃度環(huán)境(最高至添加30%乙醇，更高濃度乙醇環(huán)境會(huì)導(dǎo)致底物中T-2150析出)常溫存放30 min后，其活力和原酶液沒有顯著性差異(P>0.05)，說明右旋糖酐酶在該不利條件下對(duì)其影響是完全可逆的。

表1 常溫下右旋糖酐酶穩(wěn)定性研究Table 1 The stability of dextranase at normal temperature

2.6 食品添加劑對(duì)右旋糖酐酶的影響

選取部分常見的食品添加劑，測(cè)定其對(duì)右旋糖酐酶活力的影響，結(jié)果見表2。只有Na2SO3對(duì)右旋糖酐酶有顯著的抑制作用(P<0.05)，其他均無顯著性差異。制糖工藝中存在硫熏處理，該處理亞硫酸根濃度可能較高，可能會(huì)影響右旋糖酐酶的活性。

表2 食品添加劑對(duì)右旋糖酐酶的影響Table 2 The effect of food additives on dextranase activity

2.7 右旋糖酐酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

由于右旋糖酐酶催化右旋糖酐中的α-1,6-糖苷鍵水解，生成兩條糖鏈，仍是右旋糖酐糖鏈，即底物和產(chǎn)物是同一類物質(zhì)，難以區(qū)分。探究其反應(yīng)原理，本質(zhì)上是催化右旋糖酐的α-1,6-糖苷鍵，所以可用可反應(yīng)的α-1,6-糖苷鍵量來表示底物濃度。所以，作圖時(shí)需要知道的[S](方程4)和V(方程5)的計(jì)算公式是：

(4)

式中：[S]為反應(yīng)體系中可反應(yīng)α-1,6-糖苷鍵的濃度，mol/L；w為底物溶液右旋糖酐濃度，g/L；0.00095為反應(yīng)體系中底物溶液加入量，L；230000為右旋糖酐數(shù)均分子量，g/mol；1346為平均一條右旋糖酐糖鏈上可反應(yīng)的α-1,6糖苷鍵的個(gè)數(shù)；0.001為反應(yīng)體系的體積，L。

v=m×1000÷180÷3。

(5)

式中：v為反應(yīng)速率，μmol/min；m為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的還原端增量(以葡萄糖計(jì))，mg；1000為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，μg/mg；180為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，μg/μmol；3為反應(yīng)時(shí)間，min。

經(jīng)計(jì)算后，以[S]為橫軸、[S]/v為縱軸，能得到5個(gè)點(diǎn)，并擬合出一直線，其圖形見圖5，其回歸方程為y=3.781x+0.04994，相關(guān)系數(shù)R2=0.9875，進(jìn)一步驗(yàn)證了右旋糖酐酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程，根據(jù)直線斜率和截距求得該反應(yīng)的米氏常數(shù)Km=0.01321 mol/L，vmax=0.2645 μmol/min，根據(jù)稀釋倍數(shù)可以得出vmax=0.5153 μmol/(min·U)。

圖5 Hanes-Woolf圖Fig.5 Hanes-Woolf diagram

2.8 右旋糖酐酶的熱失活動(dòng)力學(xué)

為進(jìn)一步研究右旋糖酐酶保存和應(yīng)用時(shí)的熱穩(wěn)定性，將含200 g/L蔗糖的酶液和原酶液在60 ℃保溫不同時(shí)間后冰浴冷卻。以相對(duì)酶活力的自然對(duì)數(shù) ln(At/A0)與處理時(shí)間t進(jìn)行線性回歸。由圖6可知，兩酶液均受時(shí)間影響顯著，隨著熱處理時(shí)間的延長，酶蛋白快速變性失活，同時(shí)，時(shí)間與相對(duì)酶活力的自然對(duì)數(shù)曲線在各溫度下均呈線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98)，表明右旋糖酐酶的熱失活遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，即失活速率常數(shù)K與熱處理時(shí)間t滿足以下方程(方程6)：

圖6 熱處理對(duì)酶活的影響Fig.6 The effect of heat treatment on enzyme activity

相對(duì)酶活(%)=e-Kt×100。

(6)

式中：K為熱失活速率常數(shù)，min-1。

方程3與方程6相等，并對(duì)其運(yùn)算得到下列方程(方程7)：

(7)

得到K值后，可根據(jù)(方程8)和(方程9)計(jì)算出半衰期T1/2和D值。

T1/2=ln(2)/K。

(8)

D=ln(10)/K。

(9)

根據(jù)直線的斜率以及方程8，9得到各參數(shù)，見表3。含200 g/L蔗糖的T1/2比不含蔗糖的高14.8%，說明蔗糖對(duì)酶有一定保護(hù)作用。該條件恰好是制糖物料中的常見蔗糖濃度，說明該酶在制糖過程中使用熱穩(wěn)定性有所提升，能更好地發(fā)揮作用。

表3 右旋糖酐酶失活的一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 3 The parameters of first-order kinetics model for inactivation of dextranase

3 結(jié)論

該右旋糖酐酶的最適溫度、pH和離子強(qiáng)度分別為60/65 ℃，5.5，0.015 mol/L；pH 5.5～9.5或乙醇添加量0%～30%的環(huán)境常溫保存30 min，酶活性保持相對(duì)穩(wěn)定；酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，其Km和vmax分別為0.01321 mol/L、0.5153 μmol/(min·U)；右旋糖酐酶的熱失活遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，在60 ℃、含蔗糖0，200 g/L的環(huán)境下熱失活速率常數(shù)為0.1268，0.1105 min-1，半衰期分別為5.466，6.273 min。2 mmol/L亞硫酸鈉對(duì)右旋糖酐酶活性具有抑制作用(P<0.05)。該試驗(yàn)為制糖行業(yè)和其他行業(yè)應(yīng)用該酶提供了較詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持。