桂枝茯苓膠囊對前列腺增生模型大鼠的作用效果和機制研究*

王希濤 郝 林 周祥舉 周榮升 周家合賀厚光 張軒銘 王 建 夏 天 韓從輝**

1.徐州市中心醫院泌尿外科（江蘇徐州 221009）；2.東南大學醫學院（江蘇南京 210009）

良性前列腺增生癥 （benign prostatic hyperplasia，BPH）在泌尿男科中發病率較高，是男性最常見的泌尿生殖系統疾病之一[1]。 它被認為是前列腺間質和上皮細胞的非惡性不受控增生， 以進行性腺體和間質組織增生為特征，導致前列腺增大[2]。 前列腺增生的患者常有下尿路癥狀，如尿頻、尿急、排空感不完全、夜尿癥等都可能與BPH有關，并發癥包括急性尿潴留、尿路梗阻和尿路感染等[3]。

BPH 的病理生理學機制較復雜， 目前尚未完全明確，但是，衰老及雄激素水平的變化可能是BPH 發病的機制[4]。 前列腺組織的發育、生長和增殖依賴于雄激素受體激動劑，即雙氫睪酮（DHT）的刺激，雙氫睪酮是由前列腺內循環的睪酮合成的， 當睪酮水平減少或DHT激素水平過高時，可能會引起前列腺增生[5]。 同時，許多研究表明， 血管生成以及細胞增殖或凋亡紊亂與BPH的發生密切相關，可能是導致BPH 的重要機制[6]。 有研究顯示血管內皮生長因子（VEGF）在BPH 患者前列腺組織中高表達[7]。 TGF-β1 是轉化生長因子的一種，也有研究表明前列腺增生組織TGF-β1 水平升高[8]。

目前，BPH 的治療藥物多為單一作用靶點，比如只針對降低體內活性睪酮， 抑制雄激素， 抑制血管形成等，但治療效果并不理想。 因此，迫切需要一種針對該病作用靶點多、不良反應少的藥物用于BPH 的長期維持治療。 天然藥物，尤其是中醫藥，已被廣泛用于臨床許多疾病的治療。 近年來， 中醫藥以其獨特的療效在BPH 的藥物治療中發揮越來越重要的作用[9-11]。 中醫根據BPH 在其臨床表現，將其歸屬于中醫“癃閉”范疇，而“癃閉”的證治分類包括濁淤阻塞證，其證機概要為淤血敗精，阻塞尿道，水道不通[12-13]。 桂枝茯苓膠囊（國藥準字Z10950005）處方來源于張仲景《金匱要略》所載之桂枝茯苓丸，屬古典經方。 桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍藥等藥物組成，具有活血，化瘀，消癥之功效[14]。因此，桂枝茯苓膠囊治療BPH 也符合中醫的辨證論治原則。孫一鳴等[15]用桂枝茯苓丸加味湯劑聯合穴位注射治療BPH 50 例，發現其能有效提高療效。 劉春宇等[16]研究表明不同劑量的桂枝茯苓膠囊可以抑制實驗性大鼠的前列腺增生，減少前列腺腔擴張。 周一飛等[17]進行的多中心臨床研究表明桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生癥（淤阻膀胱癥）臨床療效確切，總有效率達到84.2%。 但是，目前缺少對桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生的相關機制研究。

本研究通過建立去勢后睪酮誘導的前列腺增生大鼠模型，使用桂枝茯苓膠囊進行干預，Elisa 檢測前列腺增生大鼠血清和前列腺組織中的DHT，通過qRT-PCR 檢測前列腺組織中VEGF 及TGF-β1 的表達水平， 觀察桂枝茯苓膠囊對前列腺增生模型大鼠體內VEGF 及TGF-β1 表達的影響，并探討其作用機制，為臨床BPH 的應用提供實驗依據和理論基礎。

材料與方法

一、實驗動物

健康性成熟雄性SD 大鼠50 只，體重約200～250g，無特定病原體（specific pathogen free，SPF 級），飼養過程，保證室內溫度20 ℃～26 ℃，濕度40%～60%，光照12 h/d，自由攝食、飲水，適應實驗室環境7d 后開始實驗。

二、主要藥物及試劑

桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業股份有限公司，國藥準字Z10950005）； 非那雄胺 （BBI 生命科學有限公司，A606226-0025）；羧甲基纖維素鈉（生工生物工程(上海)股份有限公司，A501427-250g）；橄欖油（生工生物工程(上海)股份有限公司，A502795-0100）；丙酸睪丸素（阿拉丁試劑(上海)有限公司，T101368-25g）；睪酮ELISA Kit（abcam 公司，ab108666）大鼠DHT ELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，TWp002998）；大鼠ALT ELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，tw037122）；大鼠ASTELISA Kit（上海通蔚生物有限公司，tw037120）；TGF-β1 一抗（abcam 公司，ab92486）；VEGF 一抗（proteintech 公司，19003-1-AP）。

三、主要儀器和設備

冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Power PacTMHC 電泳儀 （Bio-Rad）；VE-180 垂直電泳槽（上海天能）；DY-B1 脫色搖床（上海滬西儀器）；Tanon 4200 全自動化學發光圖像分析系統（上海天能）；中性樹膠封片劑（生工）；石蠟組織切片機（徠卡）；生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司）；光學顯微鏡（佳能）；ABI stepone plus 實時熒光定量PCR 儀(LIfe)。

四、實驗分組

將雄性SD 大鼠隨機分為5 組，每組10 只。空白組(假手術組)， 模型組， 桂枝茯苓膠囊高劑量組[0.5 g/(kg·d)]，桂枝茯苓膠囊低劑量組[0.25 g/(kg·d)]，非那雄胺組[1mg/(kg·d)]。

五、造模及給藥方法

前列腺增生大鼠模型參考文獻造模方法[18]，造模大鼠經腹腔注射4%水合氯醛溶液(3.5 ml/kg)進行全身麻醉，無菌條件下切除雙側睪丸，空白組大鼠行假手術。 經1 周自然恢復后，造模大鼠皮下注射丙酸睪酮0.5 mg/(kg·d)（溶于0.1 ml 芝麻油）造模，空白組大鼠皮下注射等體積芝麻油， 連續注射28 d 后， 麻醉下進行前列腺活組織檢查，以確認造模成功。 組織檢查達到前列腺增生標準（即前列腺上皮增生， 形成密集的皺褶或乳頭狀結構充滿腺腔，管壁增厚；部分腺體周圍間質細胞及纖維組織增生）則造模成功。

28 d 造模成功后， 空白組及模型組給予羧甲基纖維素溶液灌胃治療，各治療組予相應藥物溶于羧甲基纖維素溶液，然后連續灌胃28d，大鼠每次灌胃量10ml/(kg·d)。

六、標本采集

各組大鼠于末次給藥后，稱取大鼠體重并記錄，留靜脈血， 麻醉下完整切除雙側前列腺組織并于冰冷的生理鹽水中漂洗，仔細剝離，去除血液、脂肪等組織，稱取前列腺重量并記錄，使用4%多聚甲醛溶液固定。

七、Elisa 檢測

從已平衡至室溫的密封袋中取出實驗所需板條，加入不同濃度標準品和樣品，加入氧化物酶標記的檢測抗體，封住反應孔，37℃溫箱孵育60 分鐘，清洗后打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好程序。 加入顯色底物A、B，加入終止液50ul/孔， 混勻后即刻測量OD450 （3 分鐘內）。 在儀器保存血清和前列腺組織的DHT 讀數結果。

八、實時定量PCR

首先提取RNA， 將細胞用預冷PBS 緩沖液洗2遍，加1ml Ezol 裂解液重懸。加入0.2ml 三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3 分鐘。 4℃，12,000×g 離心20min。將上清水相轉移至另一新的無RNA 酶離心管中，并加入等體積的100%乙醇。 吸取全部樣品， 加入帶有2ml收集管的mini-spin 離心柱。 8,000×g，室溫離心15 s，棄盡流穿液。 將剩余的樣品轉移至離心柱，重復第6 步。往離心柱中加入700μl WB，輕蓋蓋子，8,000×g，室溫離心15 s，棄盡流穿液。 重復第8 步，用500μl WB 洗滌離心柱三次。 將離心柱轉移至一新的無RNA 酶的1.5ml 離心管中， 往硅膠膜中央滴加50μl DEPC 水，4℃，10,000×g 離心3min 洗脫RNA。 并通過mRNA 逆轉錄反應體系、mRNA 實時熒光定量反應體系、 定量PCR 反應程序， 最終定量測定前列腺組織的VEGF 和TGF-β1 含量。

九、統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件包進行數據分析，所得到的計量資料用±s 表示， 經正態性及方差齊性檢驗后，方差齊者組間總體的比較采用One-way ANOVA，方差不齊采用秩和檢驗； 有差異者進一步采用LSD-t 進行兩兩比較， 檢驗水準α=0.05， 血清和前列腺組織的DHT 以及前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 實施定量PCR 測定，采用GraphPad Prism 8 繪制柱狀圖。

結 果

一、各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數改變情況

一共50 只SD 大鼠進行實驗， 構建SD 大鼠BPH模型40 只，每組10 只，空白組10 只作為對照，按照公式（前列腺指數=前列腺濕重/體重）計算大鼠前列腺指數。 各組前列腺增生模型大鼠前列腺濕重、體重及前列腺指數見表1。與空白組相比，模型組的前列腺濕重明顯增加(P＜0.01)；而桂枝茯苓治療組及非那雄胺組的前列腺濕重較模型組則明顯降低(P＜0.01)；桂枝茯苓高劑量組較桂枝茯苓低劑量組的前列腺濕重降低更明顯(P＜0.01)。

表1 各組大鼠前列腺濕重、大鼠體重和前列腺指數

二、各組前列腺組織病理切片

顯微鏡（40 倍） 下正常組前列腺腺體排列規整有序，腺腔無擴張，腺上皮無任何增厚，呈單層柱狀，腺體間可見間質。 BPH 模型組腺體排列較亂,腺上皮厚度增加， 上皮細胞數量變多， 腺上皮形成乳頭狀突入腺腔內，腺腔內可見分泌物，內部空間縮小。 非那雄胺組和桂枝茯苓膠囊組腺腔擴張較少， 腺上皮細胞數目明顯少于模型組，且低柱狀上皮多見，腺腔直徑與腺上皮高度同模型組相比，差異非常顯著。 結果見圖1。

三、各組ELisa 檢測血清和前列腺組織DHT 含量

與空白組對比， 前列腺增生模型組血清DHT 含量明顯升高（16.84±1.13）mg/ml vs（4.68±0.63）mg/ml，P＜0.01；與前列腺增生模型組對比，非那雄胺組、桂枝茯苓膠囊低劑量和高劑量組血清DHT 均下降， 且P均＜0.01， 三組血清DHT 含量分別是 （9.14±1.03）mg/ml、（12.58±0.83）mg/ml、（10.52±1.32）mg/ml， 說明桂枝茯苓膠囊可以降低大鼠血清中的DHT 含量。 與空白組對比，前列腺增生模型組前列腺組織DHT 含量明顯 升高（193.96±9.97）ng/mg vs（56.20±3.76）ng/mg，P＜0.01；與前列腺增生模型組對比，非那雄胺組、桂枝茯苓膠囊低劑量和高劑量組前列腺組織DHT 均下降，且P 均＜0.01，三組前列腺組織DHT 含量分別是（88.72±7.34）ng/mg、 （154.08±10.42）ng/mg、 （121.80±7.73）ng/mg，而且桂枝茯苓高劑量組前列腺組織DHT含量比低劑量組更低，說明桂枝茯苓膠囊可以降低大鼠前列腺組織中的DHT 含量， 且高劑量組降低效果更佳。

四、 各組qRT-PCR 檢測前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 的mRNA 相對表達量

與空白組對比，前列腺增生組前列腺組織VEGF 相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，非那雄胺、桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組VEGF 降低（P＜0.05）。BPH 組前列腺組織TGF-β1 mRNA 表達量與空白組對比，表達量升高（P＜0.05）；與BPH 組比較，非那雄胺， 桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組TGF-β1 均減少（P＜0.05）。

圖1 各組前列腺組織病理切片圖（HE 染色：×40）

圖2 各組血清和前列腺組織DHT 含量

圖3 各組大鼠前列腺組織中VEGF 和TGF-β1 表達情況

討 論

BPH 目前主要發病學說包括雙氫睪酮、 間質-上皮細胞轉化、雌/雄激素紊亂、胚胎再喚醒、細胞增殖/凋亡紊亂[19-20]。中醫認為其病機是腎虛血瘀。腎氣不足，瘀濁結滯，留滯正焦，膀胱氣化不利，濁癖搏結，有形之邪，結而成瘤，凝結成塊，阻于下焦，導致局部增生，尿道不暢，排尿困難[21]。 趙軍輝認為[22]，BPH 與婦科癥瘕有相似的病機，桂枝茯苓顆泣具有補腎氣、除瘀血、通調水道之功效，可明顯緩解BPH 患者的臨床癥狀，縮小腺體體積。

本實驗將去睪丸大鼠以丙酸睪丸素成功地造成前列腺增生動物模型。 睪丸去勢可以降低內源性睪酮對本研究的影響。 模型大鼠給予桂枝茯苓膠囊治療28 d后，與模型組相比，明顯減輕前列腺質量，減小前列腺體積。 病理結果表明桂枝茯苓膠囊組與模型組相比，腺腔組織擴張較輕，增生腺上皮細胞數目也較少，腺上皮高度降低，差異較顯著。 同時，本研究結果顯示桂枝茯苓膠囊可降低模型大鼠的前列腺濕重及前列腺指數，證實了桂枝茯苓膠囊對前列腺增生大鼠有治療作用。

DHT 水平升高是較為明確的影響前列腺增生發生發展的因素，本研究桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組均降低了血清和前列腺組織中的DHT 含量， 說明通過降低DHT 可能是桂枝茯苓膠囊治療前列腺增生的機制之一。 近年來研究顯示，前列腺疾病與多種生長因子的異常表達有關，VEGF 和TGF-β1 均為前列腺增生時促進前列腺間質和上皮細胞增生的關鍵因子[23]。其中最強力的促血管生成因子之一，VEGF 在BPH 組織中的表達明顯比在正常前列腺組織中的表達增加， 有研究表明BPH 患者常帶有氧化應激特征， 其體內抗氧化酶SOD等的活力被抑制而MDA 含量顯著增加，使氧化- 抗氧化平衡態被打破[24]，導致炎癥發生。 轉化生長因子表達水平主要與前列腺炎癥有關，從而影響前列腺組織的增殖和生長[25]。 研究表明患者的前列腺基質層TGF-β1 明顯升高，也有報道TGF-β1 通過Smad 依賴的信號轉導通路引起前列腺組織的上皮-間質轉化[26-27]。 本研究結果顯示桂枝茯苓膠囊低劑量組和高劑量組均能降低前列腺組織中VEGF 及TGF-β1 的表達，以達到治療前列腺增生的目的。桂枝茯苓通過抑制VEGF 和TGF-β1 的表達可能是治療BPH 的潛在機制。

綜上所述，桂枝茯苓膠囊作為一種中醫復方制劑，是一種不同于5α- 還原酶抑制劑和α 受體阻滯劑的藥物，根據本次實驗結果，驗證了桂枝茯苓膠囊在BPH 治療中的療效及可能機制， 對臨床使用桂枝茯苓膠囊治療BPH 有一定的價值和意義。 也證實桂枝茯苓膠囊可作為BPH 臨床藥物治療的一個選擇。 但是， 桂枝茯苓膠囊治療BPH 還需更多的研究，驗證相關的其他更深治療機制。