少弱精子癥與亞甲基四氫葉酸還原酶C677T 基因多態性分布及頻率的相關性分析

張永樂 施新萍 任黎剛 陳建和 張聯珍 陳麗萍

浙江省立同德醫院基因檢測中心（浙江杭州 310012）

不孕不育癥已成為嚴重影響人類健康的世界第三大疾病，據WHO 統計，不孕不育發生率占育齡夫婦的12%～15%，全球有超過8000 萬患者，而男女發病各占50%左右[1-2]。 精子密度的改變在男性不孕不育發生率中占相當比率，約45%患者有少精子癥，20%患有無精子癥[3]。 一項連續五年的研究發現，健康成年男性精子密度平均值呈逐年下降趨勢[4]。而誘發這一因素主要原因與空氣污染、吸煙、壓力、化學毒物等相關[5-6]。近年來人們研究發現，飲食中的一些元素改變也在影響精子的功能，導致男性不孕不育的發生，從動物實驗，體外細胞培養研究結果表明， 一些營養元素在調節精子的生成、成熟和受精等方面起著重要的作用，而這些營養成份中葉酸缺乏顯得尤為突出[7]。 亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase ；MTHFR） 是一種重要的調控酶，參與葉酸代謝，而MTHFR C677T 基因的多態性直接與葉酸代謝相關[8]。 本研究以正常生育能力的男性為對照，觀察少弱精子癥患者MTHFRC677T 基因的多態性，分析基因分型分布及基因頻率與少弱精子癥的關系。

材料與方法

一、研究對象

收集2016 年3 月～2019 年12 月期間， 在浙江省立同德醫院不孕不育門診和男科門診就診的少弱精子癥患者128 例為研究對象視為觀察組， 平均年齡為32歲（23 ～38）。選擇同期正常精子質量的男性108 例視為對照組，年齡在25～40 歲，

二、觀察組納入標準[9]

至少兩次精液常規分析確定為少弱精子癥患者（診斷參照WHO 第五版），排除標準：①染色體核型異常；②Y 染色體微缺失；③精索靜脈曲張；④隱睪；⑤生殖泌尿系統病原體感染或手術； ⑥重金屬或其他環境污染物暴露者；⑦長時間高溫環境工作者。 平均年齡為32 歲（23～38）。 對照組納入標準：男方本次精液常規分析均在正常范圍內。

三、研究方法

取受試者靜脈全血2ml 置于EDTA 抗凝管中，送往本院PCR 室， 采用多重實時熒光PCR 技術進行C677T 基因多態性分析， 試劑盒為武漢友之友生物科技股份有限公司提供。 DNA 提取，裂解：取200μl 調整好的細胞溶液置于1.5ml 的無菌離心管中， 加入20μl蛋白酶K 和200ul 細胞裂解液（cell lysis solution），充分混勻后，56℃水浴10min。核酸沉淀：向裂解后的離心管中加入無水乙醇200μl 充分混勻后全部轉入帶濾膜的柱中放入離心半徑為10cm 離心機中以11180g 轉速離心2min,棄廢液。 洗滌：向柱中加入預配好的DW1 洗液600ul,再次11180g 轉速離心2min,棄廢液，再向柱中加入預配好的DW2 洗液600ul，11180g 轉速離心，2min;棄廢液，重復DW2 洗滌一次；將柱轉入潔凈離心管中11180g 轉速離心5min,棄離心管；更換另一潔凈離心管將柱置入，開蓋室溫放置5min,使殘余酒精充分揮發。 核酸洗脫：將柱植入無菌的1.5ml 離心管中，加入50μlGE洗脫液（注意洗脫液加入膜的中間，但禁止移液槍頭接觸膜），室溫放置5min，11180g 轉速離心2min，收集總DNA 模板備用， 洗脫后的總DNA 使用紫外分光光度儀進行濃度和純度的測量， 保證濃度和純度達到PCR檢 測 要 求， ( 總 DNA 濃 度 ＞20ng/μl； 純 度1.5＜A260/A280＜2.0)，DNA 模板立即進行PCR 或-70°冷凍保存， 提取試劑盒為北京天根生物科技有限公司提供。 PCR 擴增:擴增總體系20μl（反應液18μl，模板2μl）， 擴增條件為，37℃2min，95℃5min，95℃15S 58℃45S 運行40 個循環，結束擴增，儀器自動分析，根據不同的熒光報告曲線判定結果。

四、觀察指標

觀察兩組受檢者MTHFR C677T 基因多態性，具體包含純合野生型(CC)，雜合突變型（CT），純合突變型（TT）以及C,T 等位基因的出現頻率。

五、統計學分析

采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗對研究資料的可靠性分析，應用SPSS 20.0 軟件對本研究資料進行統計處理，計量資料以（±s）表示，采用t 檢驗，計數資料以“%”表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

一、觀察組和對照組年齡差異性分析

128 例觀察組年齡分布為23～38 歲，平均年齡為32 歲，108 例對照組年齡分布為25～40 歲，平均年齡為33.5 歲，兩組年齡比較t=0.876，P＞0.05,差異不具有統計學意義。

二、 研究資料基因多態性采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析選擇資料的可靠性

觀察組和對照組的所有基因型進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析， 結果顯示χ2分別為0.092 和0.027，P＞0.05, 因此所選人群基因型頻率符合遺傳平衡法則，具有恒定性，數據統計見表1。

表1 對照組和觀察組Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析結果

三、觀察組和對照組MTHFR C677T 基因型表達

觀察組中MTHFR C677T 基因表達為CC 型基因的人比率顯著低于對照組，而表達TT 型基因的比率顯著高于對照組， 兩組比較存在統計學差異P＜0.05，CT型基因表達兩組比率相當，無統計學差異P＞0.05.統計數據見表2。

表2 觀察組與對照組MTHFRC677T 基因型表達比率（%）

四、觀察組和對照組MTHFRC677T 基因中C，T 等位基因表達

觀察組中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分別為38.67%，61.33%；對照組中MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因分別為55.09%，44.91%，C，T 等位基因表達兩組存在統計學差異P＜0.05，數據統計見表3。

表3 觀察組與對照組MTHFR C677T 基因中C，T 等位基因表達頻率比較（%）

討 論

男性不育是復雜疾病。 近來研究表明，葉酸對于男性生殖健康起到至關重要作用[9]，Lambrot 等[10]人研究提示給雄性小鼠長期使用缺少葉酸的飼料可導致小鼠睪丸精母細胞減數分裂啟動延遲，Swayne 和Ly[11-12]分別報道了葉酸缺乏可致小鼠睪丸精子生成減少。 Najafipour 等[13]調查研究健康男性低葉酸攝入人群呈現精子密度顯著降低。 敲除葉酸代謝相關基因的動物模型實驗進一步證實了葉酸是保障精子正常生成的必須物質[14]。 葉酸是一種重要的水溶性B 族維生素，它的吸收、代謝常受多種酶調控，比如：亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，甲硫氨酸合成酶(MTR) 和甲硫氨酸合成酶還原酶 (MTRR) 是葉酸代謝途徑中的關鍵限速酶，而MTHFR C677T 和A1298C，MTR A2756G 及MTRR A66G 等單核苷酸多態性(SNP)的存在常影響這些酶的活性。 研究報道[15]MTHFR C677T 純合突變型TT 基因可使酶活性下降一半以上，臨床研究資料[16]指出MTHFR C677T 位點多態性與特發性男性不育的精液參數異常密切相關，進而推測葉酸代謝途徑異常，引起葉酸利用率下降，阻礙了精子的生成、發育過程，從而導致不育的發生。

本研究對少弱精子患者的觀察組與健康男性患者的對照組進行MTHFR 基因C677T 位點多態性檢測分析，結果表明，觀察組的TT 基因型和T 等位基因分布頻率顯著高于觀察組， 差異有統計學意義P＜0.05。 TT基因型的百分比和T 等位基因分布頻率與我省蔡麗偉的報道一致[17]。 其實早在2001 年德國學者Bezold 等[18]已報道不育男性TT 型基因比率顯著高于正常對照人群，提示MTHFR C677T 基因突變是導致男性不育的一因素。 此后研究印度、韓國、意大利等國男性也發現這一結論[19-20]。 但也有不同的結論Ravel 等[21]報道法國男性不育患者與MTHFR C677T 基因多態性無明顯關聯。提示MTHFR C677T 基因多態性在不同種族、地域內表現也不相同，另一方面，不同地域的飲食習慣日攝入葉酸的含量不同也可對檢測結果造成一定的干擾， 飲食中大量攝入葉酸即便MTHFR C677T 基因表現為TT型， 但體內葉酸供應充足也不會出現因少弱精子而引起不育癥[15]。

近年來研究發現高同型半胱氨酸（Hcy）血癥與多種疾病相關，邵麗佳等和戈一峰等[22-23]人的研究報告顯示高Hcy 與男性不育相關, 他們認為高Hcy 可抑制谷胱甘肽合成，谷胱甘肽為活性氧的清除物質，當谷胱甘肽減少時， 精液中活性氧產生與清除的動態平衡被破壞，造成精子生成減少、精子DNA 損傷等，最終導致精液質量降低； 此外高Hcy 血癥可能引起睪丸中血管過早發生動脈硬化，影響睪丸的血液供應，導致生精功能障礙。 而高Hcy 血癥的產生又與MTHFR C677T 基因多態性相關，TT 型基因人群更易患高Hcy 血癥。

綜上所述， 無論是因為保障精子正常生成的必須物質- 葉酸缺乏， 還是高Hcy 血癥引起的活性氧產生與清除的動態平衡被破壞或者睪丸血管過早發生動脈硬化，MTHFR C677T 基因多態性在其中扮演著重要角色。 因此對少弱精子癥患者早期進行MTHFR C677T基因多態性檢測， 評估患者是否因葉酸缺乏導致精子數量、質量下降都具有重要意義，為合理補充葉酸提供臨床依據。