微流控芯片在人類精子優選中的應用*

曹思原 陸金春 靖 俊 薛同敏 張光云 曾 嶸 姚 兵**

1. 南京師范大學生命科學學院（江蘇南京210023）；

2. 東南大學附屬中大醫院生殖醫學中心（江蘇南京210037）；

3. 東部戰區總醫院生殖醫學中心（江蘇南京210002）

近年來，男性不育患者增多，人們對輔助生殖技術的需求量有所增加[1]。 在輔助生殖技術中，從精液樣本中優選出足夠數量的高質量精子是輔助生殖技術成功的關鍵步驟之一。 目前，臨床上常規使用的精子優選方法為上游法和密度梯度離心法， 它們均能提高優選后的精子活力，并回收一定數量的精子。 然而，無論上游法還是密度梯度離心法， 其操作過程繁瑣且均涉及機械力操作，這可能會導致精子中的氧自由基水平升高，增加DNA 損傷，降低精子質量[2]。 因此，臨床上迫切需要一種更有效的精子優選方法。 上世紀九十年代初，微流控技術正式誕生， 它是建立在幾平方厘米芯片上的生物或化學實驗室， 將實驗中各種零散操作整合在芯片中完成，縮短了實驗時間，提升了實驗靈敏度，節約了實驗成本[3]。此后，其在精子優選中的應用逐漸被廣泛研究[4]。 Nosrati 等[5]設計的微流控芯片優選人類精子后，其精子DNA 完整性顯著提升，且優選效率高。 Parrella等[6]設計的微流控芯片優選人類精子后，其精子活力與正常形態精子百分率較密度梯度離心法顯著提高，DNA 損傷率較密度梯度離心法顯著降低。Nakao 等[7]設計的微流控芯片優選小鼠精子后其精子活力、頂體完整性以及受精率均顯著升高。 然而，絕大部分微流控芯片設計、制作復雜，原料成本過高，不利于大批量生產應用。 本研究自行設制一種靈巧簡便、成本低廉的微流控芯片裝置優選精子，并將優選后的精子活力、濃度、DFI與上游法和密度梯度離心法進行比較。

材料與方法

一、實驗對象

精液樣本源自我院生殖醫學中心的男性不育患者， 患者禁欲2～7 d 后手淫取出精液置于無菌采集器中，于37℃恒溫水溫箱中液化1h。 本研究經我院倫理委員會批準，并獲患者知情同意。

二、試劑與儀器

人輸卵管液培養液（HTF）、密度梯度離心液購于美國SAGE 公司， 精子核完整性檢測試劑盒購于南京欣迪生物藥業工程有限責任公司。

CASA 系統購于北京偉力公司，流式細胞儀購于美國BD 公司。

三、微流控芯片

由本團隊陸金春博士自行設計 （專利申請號：201910465724.6）， 以 聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯（polymethyl methacrylate，PMMA）為制作材料。 裝置內部由環形薄壁分為內外兩圈，外側圈中可加入精液樣本（不漫過薄壁最高處），內側圈中加入HTF 直至漫出薄壁進入外圈層，與精液形成分層，整個液面略高于薄壁，質量好的精子具有貼壁游動的特性， 可先貼薄壁外側游動至HTF 上層，再貼薄壁內層游入內圈層中，從而達到濃縮和篩選優質精子的目的。

四、微流控芯片的安全性研究

每份精液各取300μL分別置于芯片內圈中和無毒滅菌離心管中室溫放置， 每組在1h、2h、3h、4h 時各吸取5μl 精液，測其精子活力。

五、微流控芯片優選精子不同時間的效果比較

取1ml 精液樣本加入芯片外圈中，靜置5min 后在芯片內圈中緩緩加入480μLHTF，使其漫過內圈最上方并與外圈中精液形成分層，37℃、5%CO2培養箱中靜置， 分別在40min、60min、80min 時吸取內圈中5μl 混勻的HTF，測其精子活力與濃度。

六、三種不同方法優選精子的比較

分別用微流控芯片法、 上游法和密度梯度離心法優選精子。

微流控芯片法：同“五、微流控芯片優選精子不同時間的效果比較”， 最后回收的HTF 補足至500μl，并測其精子活力、濃度與DFI。

上游法：于無毒滅菌離心管中加入1mL精液，300×g離心5min，棄上清后加入500μl HTF 重懸沉淀，在上方緩緩加入1mL HTF 形成分層， 離心管45°傾斜置于37℃、5%CO2培養箱中上游1h， 回收最上方500μL HTF，測其精子活力、濃度與DFI。

密度梯度離心法： 于無毒滅菌離心管中依次加入80%、40%密度梯度離心液，將1ml 精液樣本緩緩加入離心液上層，300×g 離心20min，棄上清后加入2mL精子洗滌液重懸沉淀，200×g 離心5 min， 棄上清后加入500μL精子洗滌液重懸沉淀，測其精子活力、濃度與DFI。

七、精子各參數測定

精子活力與濃度檢測：參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版，用CASA 系統檢測。

精子DFI 檢測： 參照精子核完整性檢測試劑盒說明書操作，用吖啶橙對精子進行染色，染色后的精子懸液通過流式細胞儀檢測其DFI。

八、統計學分析

用SPSS17.0 分析數據， 差異性比較前對數據進行正態分布檢測，若每組數據均符合正態分布，用±s 表示計量資料，若有數據不符合正態分布，則用M（QR）表示計量資料。 除微流控芯片法與上游法、微流控芯片法與密度梯度離心法優選前后各精子參數進行組間比較時使用Mann-Whitney U 檢驗外，其余均用Wilcoxon 符號秩檢驗進行組間比較，P＜0.05 為有統計學意義的差異。

結 果

一、微流控芯片的安全性研究

無毒滅菌離心管和微流控芯片中精子活動率與前向運動精子百分率在各個時間段均無顯著性差異（P＞0.05）（表1），提示微流控芯片對精子無毒害作用。

表1 不同時間點兩組中精子活力比較[n=30，M（QR）]

二、微流控芯片優選精子不同時間的效果比較

與優選前相比， 微流控芯片優選40min、60min 和80min 后的精子活動率與前向運動精子百分率均顯著升高（P＜0.01），精子濃度則顯著降低（P＜0.01）；40min、60min 和80min 三組之間優選后的精子活動率與前向運動精子百分率無顯著性差異（P＞0.05）；與40min 組相比，60min 組與80min 組優選后的精子濃度均顯著升高（P＜0.05），60min 組與80min 組的精子濃度則無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。 提示60min 為微流控優選精子的最佳時間。

表2 微流控芯片優選不同時間后各精子參數的比較[n=10，M（QR）]

三、三種不同精子優選方法的效果比較

三種方法優選前各精子參數均無顯著性差異（P＞0.05）。 較優選前，三種方法優選后的精子活動率與前向運動精子百分率均顯著升高（P＜0.01），微流控芯片與上游法優選后的精子濃度顯著降低（P＜0.01），密度梯度離心法優選后的精子濃度沒有差異；與優選前相比，微流控芯片優選后的精子DFI 無顯著性差異（P＞0.05），上游法與密度梯度離心法優選后的精子DFI 顯著升高（P＜0.01）；與上游法與密度梯度離心法相比，微流控芯片優選后的精子活動率與前向運動精子百分率均顯著升高（P＜0.01），而精子濃度與DFI 則顯著降低（P＜0.05）（表3）。

討 論

據WHO 報道，不孕不育發病率高達10%～15%，而男性因素則約占一半[8]。 隨著輔助生殖技術的發展，越來越多不孕不育家庭借此技術得到幸福。 然而，當前輔助生殖成功率只有約三分之一[9]。 目前應用于臨床的輔助生殖技術包括人工授精（artificial insemination，AI）、體外受精（in vitro fertilization，IVF）以及卵胞漿內單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），無論哪種技術，都需要先對精子進行優選，提升優選后的精子質量將成為提升受精成功率的關鍵[10]。

表3 三種方法優選前后各精子參數比較[n=20，M（QR）]

本研究中我們自制PMMA 微流控芯片對精子進行優選。 PMMA 俗稱有機玻璃，其光學特性好、穩定性強、耐腐蝕、易成型，經常應用于各種工藝品以及生物醫學檢驗芯片的制作[11,12]。 本研究所設計的微流控芯片采用有機玻璃為原料，通過安全性研究實驗證明，與無毒滅菌離心管類似，其對精子無毒害，適合在微流控芯片生產中使用。

長期以來， 精子活力與濃度都是臨床上評價精子質量的重要指標。 微流控芯片優選后的精子活動率與前向運動精子百分率均優于上游法與密度梯度離心法，這可能是因為與這兩種方法相比，微流控芯片優選精子過程中避免了樣本的多次轉移， 減少了操作過程中對精子造成的致命損傷。 但是，微流控芯片優選后的精子濃度遠遠低于這兩種方法， 可能是因為貼壁游動對精子要求高， 這樣的結果不利于優選精子后的宮腔內人工授精（IUI）過程，尤其是少精子癥患者。

隨著輔助生殖技術的發展， 人們也逐漸開始從微觀水平分析精子質量，精子DNA 完整性近年來成為關注熱點。 精子活力、濃度等僅是從高活力精子產生數量方面分析精子，并不能準確預測其生育能力，一次成功的受精依賴于精子中高完整性的DNA 分子。 有研究表明，精子DNA 片段化高與受精率低相關[13]。 微流控芯片優選后的精子DFI 低于上游法與密度梯度離心法，這可能是因為微流控芯片在優選過程中無需離心，避免了其對精子帶來的機械損傷與氧化應激。

綜上所述，與傳統精液分選方法相比，本研究所設計的微流控芯片操作簡便，價格低廉，能優選出質量更高的精子；盡管在某些方面仍需改善，但其在輔助生殖技術中尤其是在IVF/ICSI 技術中已顯示出良好的應用前景。