血液環境下Biodentine 與MTA 的顏色穩定性研究

王怡天， 吳寅龍， 余釩源， 吳凡子， 汪成林， 葉玲

1. 口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫院牙體牙髓科，四川 成都（610041）； 2. 口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫院，四川 成都（610041）； 3. 山東大學齊魯醫學院口腔醫學院·口腔醫院牙體牙髓科 山東省口腔組織再生重點實驗室 山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，山東 濟南（250000）

美國牙髓病學協會（American Association of Endodontics，AAE）關于再生性牙髓治療的臨床建議（2018 版）中提出，在血凝塊或其他血液制品上需要覆蓋一層蓋髓材料。該蓋髓材料需具有良好的封閉性和生物相容性。目前常用的蓋髓材料為三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregrate，MTA）和Biodentine。臨床研究發現，MTA 可能具有導致牙體頸部變色的美學風險［1-2］。臨床上為避免MTA 材料導致的牙變色，往往采用牙頸部涂布粘接劑來避免材料進入牙本質小管從而發生反應。然而牙髓血運重建術中蓋髓材料會長時間、大面積地與血液接觸，甚至會有部分材料會完全沉浸于血凝塊中，此時材料的變色會直接透過牙體組織導致變色。該類變色臨床上更難以預防，因此牙髓血運重建術過程中對材料在與血液接觸環境中的顏色穩定性有較高的要求。蓋髓材料中，基于牙本質替代物設計理念的Biodentine 在光氧［3］、沖洗液［4-5］等接觸條件下均表現出了良好的顏色穩定性。本研究旨在比較Biodentine 和MTA 與血液直接接觸后的顏色穩定性。由于體內環境相較于體外實驗環境更為復雜，因此本實驗首先探究單純的體外血液環境對Biodentine 和MTA 顏色穩定性的影響。本研究回答了兩種材料在體外血液環境下的變色情況，是進一步探討牙體變色有關因素的基礎，為臨床蓋髓材料的使用提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

MTA（Dentsply，美國）；Biodentine（Septodont，法國）（表1）；硅橡膠（DMG 塞拉格，德國）；48 孔板（Corning，美國）；脫纖維羊血（九龍生物，鄭州）；去離子水（Millipore，美國）。Crystaleye 分光光度計電腦比色儀（CE100-DC/EU，Olympus，日本）；佳能數碼照相機（PowerShot SX720 HS，佳能，日本）；In-spect F50 掃描電鏡（FEI Inspect F50，FEI，美國）；X射線能譜儀（INCA350，Oxford，美國）。

表1 兩種材料的基本顏色和組成Table 1 Basic color and composition of the two materials

1.2 圓盤制備和處理

制作直徑5 mm、高3 mm 的鋁制圓盤，以此為模型使用硅橡膠制作圓盤印模。按照材料說明書調制Biodentine 和MTA，放入硅橡膠印模中，置于37 ℃、100%濕度的恒溫箱中4 h。待材料固化后脫模，得到直徑5 mm、高3 mm 的Biodentine 和MTA圓盤。

分組：采用隨機數表法將同一材料的24 個圓盤隨機平均分配到去離子水1 d 組、去離子水7 d組、脫纖維羊血1 d 組、脫纖維羊血7 d 組，每組6 個圓盤。于48 孔板中進行浸泡處理，避光放置于37 ℃恒溫箱中。浸泡7 d 組中的液體（去離子水或脫纖維羊血）每天更換。

1.3 Biodentine 和MTA 圓盤顏色比較

1.3.1 比色法 使用去離子水對固化脫模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圓盤沖洗5 min，晾干2 h 后使用Crystaleye 分光光度計電腦比色儀進行比色。每個圓盤重復測量3 次。所有測量均在同樣的室內光照條件下進行，樣本均按操作說明一致擺放。采用國際照明委員會CIE L*a*b*色度系統，獲取材料表面各部的明度值（L*）、紅綠色度坐標軸的色度值（a*）、黃藍色度坐標軸上的色度值（b*）；與其在固化脫模后即刻的值L0*、a0*、b0*對應求差，得到ΔL、Δa、Δb。計算各組處理前后的色差值ΔE，

ΔE ＝［（L*-L0*）2+（a*-a0*）2+（b*-b0*）2］1/2。1.3.2 目測法 使用去離子水對固化脫模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圓盤沖洗5 min，晾干2 h 后使用佳能數碼相機在同樣光照條件下對固化脫模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圓盤進行拍照，觀察比較圓盤的顏色變化。

1.4 表面形態觀察

取固化脫模后即刻、浸泡1 d 和7 d 后的圓盤，使用去離子水沖洗后晾干，固定于基座，表面噴鍍金屬，于Inspect F50 場發射電子顯微鏡下觀察材料表面，電壓20 kV。掃描電鏡下放大2 000倍、10 000倍觀察不同處理條件下兩種材料的表面形態。

1.5 元素含量檢測

測定區域同1.4。用X 射線能譜儀測量固化脫模后即刻、脫纖維羊血組浸泡7 d 后的Biodentine和MTA 材料中鈣、硅、碳、氧、鉍、鋯元素含量。

1.6 統計學分析

采用Graphpad Prism 6.0 軟件進行統計分析。對各組計量資料進行正態性檢驗，數據服從正態分布用均數± 標準差（±s）表示，方差齊采用t 檢驗，方差不齊則用t′檢驗。檢驗水準α ＝0.05。

2 結 果

2.1 Biodentine 與血液接觸條件下的顏色穩定性優于MTA

2.1.1 目測照片結果 去離子水組浸泡1 d 后Bio-dentine 和MTA 圓盤均沒有出現明顯的明暗度和色彩度的改變（圖1）。脫纖維羊血組浸泡1 d 后Bio-dentine 圓盤表面有較多血色物質吸附，色彩度上發生一定程度的改變，但明暗度上并沒有明顯變化；而MTA 圓盤表面只有一小部分血色物質吸附，在明暗度上發生目測可見的改變。去離子水組浸泡7 d 后Biodentine 圓盤在顏色上變化較小且表面有白色晶體析出；而MTA 圓盤顏色變化較大：暗度增加且顏色偏黃。脫纖維羊血組浸泡7 d 后兩者均發生較大變化，其中Biodentine 圓盤顏色略有加深偏紅而MTA 圓盤暗度明顯增加且顏色加深變紅。

2.1.2 比色儀結果 Biodentine 和MTA 圓盤在去離子水和脫纖維羊血組浸泡1、7 d 后，處理前后色差值變化ΔE 見表2。去離子水組浸泡1 d 后Bioden-tine 的色差值ΔE（2.937 ± 0.099）低于MTA 的ΔE（6.163 ± 0.241），差異有統計學意義（t＝21.437，P ＜0.001）。脫纖維羊血組浸泡1 d 后Biodentine 的ΔE（6.790 ± 0.831）與MTA 的ΔE（6.233 ± 0.888）之間差異沒有統計學意義（t＝0.793，P＝0.472）。去離子水組浸泡7 d 后Biodentine 的色差值ΔE（4.063± 0.450）低 于MTA 的ΔE（13.427 ± 0.926）（t＝15.752，P ＜0.001）。脫纖維羊血組浸泡7 d 后Bio-dentine 的ΔE（5.833 ± 0.501）也 低 于MTA 的ΔE（21.257 ± 0.955），差 異 具 有 統 計 學 意 義（t＝24.781，P ＜0.001）。在去離子水組浸泡1、7 d 和在脫纖維羊血組浸泡7 d 后Biodentine 的色差值均低于MTA 的色差值，而在脫纖維羊血組浸泡1 d 的兩種材料圓盤色差值之間差異無統計學意義。以上結果表明：與血液長時間接觸后Biodentine 的顏色穩定性優于MTA。

Figure 1 Photographs of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood at different time points圖1 Biodentine 和MTA 圓盤浸于去離子水或脫纖維羊血中不同時間的照片

就材料自身與液體接觸前后的色度變化而言，Biodentine 在去離子水組浸泡7 d 的ΔE 比1 d的ΔE 略高（t＝4.239，P＝0.013）；而在脫纖維羊血組浸泡7 d 的ΔE 與1 d 的ΔE 差異無統計學意義（t＝1.707，P＝0.163）。MTA 在去離子水組和脫纖維羊血組浸泡7 d 后的ΔE 均高于相應1 d ΔE，差異具有統計學意義。見表2。上述結果表明：在與血液接觸的環境中，Biodentine 具有較好的顏色穩定性且優于MTA。

表2 Biodentine 和MTA 圓盤浸于去離子水或脫纖維羊血中不同時間的色差值ΔETable 2 ΔE of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 1 day or 7 days ±s

表2 Biodentine 和MTA 圓盤浸于去離子水或脫纖維羊血中不同時間的色差值ΔETable 2 ΔE of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 1 day or 7 days ±s

The horizontal direction shows the statistical results of the 7th day ΔE and the 1st day ΔE of the material itself in the same immersion liquid. The verti-cal direction shows the statistical results of the two materials ΔE under the same conditions. There was no statistically significant difference between the 7th day ΔE and the 1st day ΔE of Biodentine immersed in defibrinated sheep blood. There was a statistically significant difference between the 7th day ΔE and the 1st day ΔE MTA immersed in defibrinated sheep blood.MTA:mineral trioxide aggregate

t P t P Biodentine MTA 4.239 13.145 0.013＜0.001 1.707 19.956 0.163＜0.001 tP Deionized water 1 d 2.937±0.099 6.163±0.241 21.437＜0.001 Deionized water 7 d 4.063±0.450 13.427±0.926 15.752＜0.001 Defibrinated sheep blood 1 d 6.790±0.831 6.233±0.888 0.793 0.472 Defibrinated sheep blood 7 d 5.833±0.501 21.257±0.955 24.781＜0.001

ΔE 的構成包括明度、紅綠色度、黃藍色度差值（ΔL、Δa、Δb），分析上述三個細化指標后發現：MTA 色度變化的主要來源是明度差值ΔL，且無論在去離子水或者血液浸泡的條件下7 d 后的明度差值ΔL 都遠大于Biodentine（圖2）。在紅綠色度差值（Δa）方面差異具有統計學意義；黃藍色度差值（Δb）方面，MTA 與Biodentine 在血液浸泡后的變化差異無統計學意義。上述結果表明，Biodentine在血液環境中顏色穩定性高于MTA 的主要原因就是其明度穩定性更高。

Figure 2 Comparison of ΔL，Δa and Δb of Biodentine and MTA immersed in deionized water or defibrinated sheep blood for 7 days圖2 Biodentine 和MTA 浸于去離子水或脫纖維羊血中7 d 的ΔL、Δa、Δb 比較

2.2 Biodentine 和MTA 表面形態變化趨勢不同

使用掃描電鏡觀察到Biodentine 圓盤未處理時表面孔隙率?。▓D3）。去離子水組浸泡后Bioden-tine 圓盤表面可見片狀結晶，而在脫纖維羊血組浸泡后表面亦有結晶但數量少于去離子水組。MTA圓盤未處理時表面可見片狀晶體，在去離子水浸泡后表面有邊緣較銳的結晶，但在脫纖維羊血組浸泡后表面結晶邊緣變圓鈍。值得注意的是兩種液體環境下各時間點時MTA 的孔隙率都明顯大于Biodentine。

2.3 Biodentine 和MTA 材料中元素含量變化不同

X 射線能譜儀測量結果顯示（圖4）：脫纖維羊血組浸泡7 d 后，MTA 中氧元素含量下降、鉍元素含量上升，提示其阻射劑成分氧化鉍可能分解成金屬鉍。Biodentine 因阻射能力低未被檢測出鋯元素（X 射線檢測發現Biodentine 的阻射能力低于MTA），但其他元素氧、鈣、硅含量穩定，提示其阻射劑成分氧化鋯可能較為穩定，不易分解。

3 討 論

作為一種骨水泥封閉劑，MTA 因其良好的生物相容性、強密合性、抑菌性等優點在臨床應用廣泛，但其潛在的變色風險仍是美學修復中不可忽視的問題［1-2］。關于其變色原因多數研究認為：MTA 中阻射劑成分氧化鉍會受光氧、沖洗液環境影響分解生成黑色金屬、或反應生成有色的碳酸鉍從而變黑；以及其他金屬氧化物造成的變色［6-7］。此外材料組分氧化鉍可與牙本質內膠原成分反應發黑［8］，血液接觸也可能與變色有關［9］。許多離體牙實驗設計未能清楚劃分造成變色的幾種因素，得到材料本身及生物成分原因混合影響的結果［8-11］。綜上，造成牙體顏色變化的可能原因包括：與血液接觸后材料本身顏色不穩定；材料、血液滲入牙本質小管與管內膠原成分發生反應；血液本身影響牙齒顏色。本實驗首先研究體外血液環境下材料的顏色穩定性，推測牙體變色是否與上述第一個可能因素即材料在血液接觸條件下的顏色穩定性有關。本研究設計體外實驗排除了生理條件中各種復雜因素的干擾，能夠單純并直接地觀察材料本身受血液影響的情況。

Figure 3 Morphological characteristics of Biodentine and MTA discs immersed in deionized water or defibrinated sheep blood at different time points detected by scanning electron microscopy圖3 掃描電鏡檢測浸于去離子水或脫纖維羊血中不同時間的Biodentine 和MTA 的形態學特征

Figure 4 Results of elemental content determination of Biodentine and MTA discs immersed in defibrinated sheep blood for 7 days compared with untreated discs圖4 脫纖維羊血組浸泡7 d 的Biodentine、MTA 與未處理組元素含量測定結果

關于Biodentine 和MTA 在血液環境中的顏色穩定性研究，有報道曾在離體牙根管內放置泡沫塑料后注入人血，釉牙骨質界處放置MTA 及Bio-dentine 等硅酸鈣類骨水泥材料后封閉根管兩端［12］。該研究的結果發現：隨著時間延長各組間的牙體變色均加重，但各材料間的變化沒有統計學意義［12］。但上述研究存在以下局限：①人體血液在體外會迅速凝固，因此在注入血液的過程中可能出現局部的凝集；②泡沫導致血液與材料接觸面積受限。因此該實驗的方法設計尚不能準確評估各材料與血液接觸后的顏色穩定性。而截止目前其余關于血液影響材料顏色的研究也僅是模擬血液污染如放置血液飽和的棉球［13-14］，這也不能反映治療中材料與血液長期接觸的真實情況。為了避免上述實驗的問題，本實驗采用浸泡方式使材料圓盤與血液接觸完全并選擇羊血脫纖維處理確保血液不會發生凝固。在本實驗的條件下，筆者得出結論：在體外與血液接觸的環境中，Bioden-tine 的顏色穩定性優于MTA。

骨水泥材料引起牙體變色的多項獨立研究顯示，MTA 在處理7 d 后已明顯致色［10，15］。本實驗依此選擇7 d 為檢測時間點，靈敏且經濟地完成檢測。本實驗是針對體外血液環境進行的研究，故設置成分單一的液體環境即去離子水作為對照，排除一切可能存在的鹽離子影響。實驗采用脫纖維羊血避免血液凝固，關于脫去的纖維蛋白原是否會對材料致色產生影響目前尚無報道，還需進一步實驗來回答。

本研究目測照片中去離子水組MTA 材料圓盤發生顏色變化，其ΔE 均高于Biodentine 相應組別，主要與MTA 材料組分、性質有關。MTA 中存在多種金屬元素，其分解釋放會降低材料明度；去離子水的浸泡會一定程度上改變材料表面孔隙率。就MTA 圓盤而言，脫纖維羊血浸泡7 d 相比于去離子水浸泡7 d 顏色發生較大改變。已知血液紅細胞會引起牙體變色［16］，由早期偏紅色逐漸轉為暗棕色。研究認為紅細胞溶血是明暗度變化的原因。有研究提示，硅酸鈣類材料與血液接觸時變色加快［9］，但具體原因尚不明確。有學者認為，MTA 中少量三價鐵會導致變色，且血紅蛋白中二價鐵因發生氧化還原反應轉化為三價鐵而變色［17］。血液還會吸附在材料表面，導致變色并抑制水化過程［18-19］，降低材料表面孔隙率，這與本研究的掃描電鏡結果一致，浸泡在血液組的材料表面孔隙率均有降低，提示材料表面存在血液的吸附。

在比較幾類骨水泥材料對牙體顏色影響的相關研究中，Biodentine 會造成牙體變色但致色情況低于MTA［20］。學者的分析結論與本實驗研究結果一致，Biodentine 金屬元素含量少、阻射劑由氧化鉍更換成了穩定性更高的氧化鋯（不易分解），這有助于顏色穩定性。這些離體牙實驗設計中都存在材料和牙本質的接觸。而已有研究表明防止牙本質小管內膠原成分的降解可大大改善牙體變色［21］說明牙本質成分對牙體顏色有較大影響。此外，血液污染也是引起牙體變色的重要因素。有研究顯示血液污染材料后處理好的牙體避光保存于37 ℃180 d 進行檢測，MTA、Biodentine 均造成牙體變色［22］。但從其結果可見，檢測時長達180 d 時Biodentine 組的變色情況較輕，MTA 組變色較重。綜上可知，現有研究條件下Biodentine 的顏色穩定性總是優于MTA。盡管實際使用中Biodentine 也存在造成牙體變色的情況，但美學修復效果與MTA 相比已獲得較大改善。

關于本實驗發現Biodentine 具有更高的顏色穩定性的機制之一，即阻射劑的更換，以下問題在臨床實踐中需要納入考慮。X 射線能譜（energy dis-persive spectroscopy，EDS）分析結果表明：在血液環境中浸泡后Biodentine 的氧元素含量都沒有變化，提示其阻射劑氧化鋯成分穩定未分解；而MTA的阻射劑氧化鉍穩定性低于氧化鋯。雖然Bioden-tine 更換阻射劑成分減輕了其變色的風險，但Bio-dentine 的阻射能力低［23］有可能會給牙體牙髓治療帶來不便，因此在實際應用時需綜合考慮需求進行選擇。

臨床治療中材料與血液接觸時處于未完全凝固的狀態。在牙髓血運重建術過程中該部分未完全凝固即接觸血液的材料往往位于牙釉本質界以下3 mm，其變色與臨床口內可見的牙體部分關系不大。而與臨床口內可見的牙體變色密切相關的通常是靠近牙釉質牙本質界的材料部分，因此本實驗選擇材料凝固后浸泡處理來模擬臨床。盡管本實驗不能完全模擬實際臨床操作狀態，但本實驗為比較兩種材料在血液接觸條件下的顏色穩定性提供了最基礎和有力的體外證據。后續本課題組將設計體內試驗模擬臨床操作狀態，探討實際治療中材料蓋髓對牙體顏色的影響；同時會考慮使用粘接劑封閉牙本質小管，探究臨床操作中若減少材料與牙本質小管的接觸能否改善牙體變色。該設計或許可以分析回答臨床使用Biodentine也會出現牙體變色的原因，并有助于探尋美學修復方面更優秀的治療方案。

綜上，本研究發現在體外與血液接觸的條件下Biodentine 的顏色穩定性優于MTA。原因包括：Biodentine 的表面形態和晶體結構在血液接觸環境中較MTA 更穩定，且Biodentine 的阻射劑及氧化物組分與血液接觸后也表現出更好的穩定性。但由于Biodentine 更換阻射劑后帶來的阻射能力降低，在臨床應用時需綜合考慮。

【Author contributions】 Wang YT，Wu YL wrote the article. Yu FY，Wu FZ，Wang CL performed the experiments，and analyzed the data. Ye L designed the study，and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.