基于“免疫微環(huán)境調(diào)控”的屏障膜研發(fā)理念

陳澤濤， 林義雄， 楊杰婷， 黃寶鑫， 陳卓凡

1.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院口腔研究所/種植科，廣東省牙頜系統(tǒng)修復(fù)重建技術(shù)與材料工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州（510055）； 2. 中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院種植科，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東 廣州（510055）； 3.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院珠江新城門診，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東 廣州（510055）

頜面部腫瘤、外傷、牙周炎癥及牙齒缺失等導(dǎo)致的牙槽骨缺損在口腔臨床上常見，其發(fā)病率高達83%，且隨著年齡增長愈發(fā)嚴重［1］。牙槽骨缺損會導(dǎo)致牙根或種植體暴露，使牙菌斑易于積累并導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。炎癥如果沒有得到及時徹底的治療，會逐漸發(fā)展破壞牙槽骨導(dǎo)致牙槽骨吸收，最終造成牙齒或種植體松動、脫落。此外，牙槽骨骨量不足會增加缺失牙修復(fù)的難度及風(fēng)險，降低修復(fù)治療的療效［2］。隨著人口老齡化進程的不斷加速，食物及環(huán)境污染的不斷加劇導(dǎo)致的腫瘤及畸形發(fā)病率增加，牙槽骨缺損已經(jīng)成為嚴重影響人們身心健康的疾病［3］，至今在臨床工作中仍是棘手且急需解決的臨床問題。因此，如何實現(xiàn)骨組織的再生成為缺損修復(fù)的關(guān)鍵。

對于牙槽骨骨量不足的病例，引導(dǎo)骨組織再生（guided bone regeneration，GBR）已經(jīng)在臨床上獲得了良好的療效［4］。由于牙槽黏膜直接襯附于牙槽骨表面，并且其生長速度比骨組織快，軟組織更容易長入骨缺損進而干擾骨組織再生，因此需要使用屏障膜將骨再生區(qū)域與軟組織分隔開，以提供充足的時間及空間引導(dǎo)成骨細胞進入，介導(dǎo)骨組織再生［5］。大量臨床研究表明，GBR 對典型的牙槽骨缺損即水平骨缺損療效確切，而對較大范圍的骨缺損及垂直骨缺損療效可預(yù)期性較差［6-7］。因此，研發(fā)具有穩(wěn)定且高效的屏障膜來提高引導(dǎo)骨再生療效具有重要的臨床意義。本文首先述評了屏障膜的發(fā)展沿革并解析不同階段屏障膜研發(fā)理念及其不足之處，進一步結(jié)合本課題組新近在涉及屏障膜與免疫系統(tǒng)交互作用的研究成果，提出基于“免疫微環(huán)境調(diào)控”的屏障膜研發(fā)理念，指導(dǎo)新一代“免疫微環(huán)境調(diào)控”屏障膜的研發(fā)，從而提高引導(dǎo)骨再生修復(fù)效果。

1 屏障膜的發(fā)展沿革及其研發(fā)理念和不足

回顧屏障膜發(fā)展沿革，最早的屏障膜研發(fā)主要是針對其理化性能及屏障功能，即能夠阻擋牙槽骨周圍成纖維細胞及上皮細胞的入侵，維持骨再生空間的同時對機體無毒副作用［8］。早在1982年，Nyman 等［9］就已經(jīng)在非人靈長類上使用基于醋酸纖維素的細菌濾膜作為GBR 屏障膜，并觀察到了牙周組織的再生。最早的屏障膜為不可吸收屏障膜，包括膨脹型-聚四氟乙烯、致密型-聚四氟乙烯、鈦網(wǎng)、以及鈦網(wǎng)加強的膨脹型-聚四氟乙烯膜［10-11］。然而，不可吸收屏障膜更多關(guān)注了理化及屏障性能，其不可降解的特性使得患者需要接受二次手術(shù)將屏障膜取出［12］，同時其設(shè)計沒有考慮對軟組織愈合的影響，使得創(chuàng)口開裂、感染的發(fā)生率較高［13］。

針對不可吸收屏障膜的不足，研究者更多地關(guān)注降解性能與生物相容性，即通過使用具有良好生物相容性以及可降解的生物材料，開發(fā)出兼具屏障功能與降解性能，且擁有良好生物相容性的屏障膜。

可吸收屏障膜的成分主要可分為天然多聚物與合成多聚物兩大類［14］。由于天然多聚物保留了原有的理化結(jié)構(gòu)，因此具有良好的生物相容性能夠誘導(dǎo)細胞長入，同時其降解產(chǎn)物與機體代謝產(chǎn)物相同，對機體無害。這其中，膠原膜在牙槽骨再生中得到了廣泛的應(yīng)用，并且在水平骨缺損的GBR 治療中取得了肯定的療效［15］。然而，膠原膜降解速度過快，空間維持能力不佳，且有潛在傳播疾病的風(fēng)險［16］。天然多聚物的不足，促成了合成多聚物的研發(fā)與運用。合成多聚物屏障膜主要由聚酯合成，部分合成多聚物屏障膜已商品化并在動物及人體上取得了良好的療效［17］。合成多聚物不僅具有良好的生物相容性，而且能夠通過調(diào)控其組分、濃度、制備工藝或理化交聯(lián)等手段調(diào)控其降解速度及機械性能［18-19］，但其酸性降解產(chǎn)物可能會干擾骨組織再生［20］。盡管可吸收屏障膜的理化及降解性能在不斷優(yōu)化，但可吸收屏障膜在垂直骨缺損及大范圍骨缺損中的療效仍然不具備可預(yù)期性［6-7］。

屏障膜的植入，不可避免地會改變整個局部微環(huán)境。真正調(diào)控骨再生過程的是屏障膜與多系統(tǒng)及細胞相互作用后所形成的新的局部微環(huán)境，而不僅僅依靠屏障膜的屏障及空間維持功能。簡單地將屏障膜視為一個物理屏障，而忽略其他系統(tǒng)細胞及其形成的微環(huán)境所研發(fā)的屏障膜將可能對局部微環(huán)境產(chǎn)生不當?shù)恼{(diào)控，導(dǎo)致不利于骨再生的局部微環(huán)境產(chǎn)生及失敗的體內(nèi)成骨。這提示屏障膜的研制不應(yīng)只關(guān)注和強調(diào)膜的屏障功能，更應(yīng)關(guān)注屏障膜與多系統(tǒng)及細胞相互作用后局部微環(huán)境的改變。新一代屏障膜應(yīng)該強調(diào)對“局部微環(huán)境”的調(diào)控，才能避免屏障膜潛在的“微環(huán)境調(diào)控缺陷”，滿足迫切的臨床需求。

2 屏障膜與免疫微環(huán)境的相互作用及其指示意義

屏障膜作為“異己”成分植入體內(nèi)后，會引發(fā)宿主持續(xù)的免疫反應(yīng)即異物反應(yīng)。生物材料植入機體后，血液從損傷的血管中滲出與材料表面接觸并相互作用，繼而血漿中的蛋白（白蛋白，球蛋白，纖維蛋白原等）、脂質(zhì)及糖類迅速并自發(fā)地吸附到材料表面。其中，吸附的纖維蛋白原會暴露兩個正常狀態(tài)下隱匿的兩個表位P1（γ190-202）和P2（γ377-395），進而觸發(fā)凝血過程并激活補體通路。隨后，大量中性粒細胞浸潤聚集于生物材料周圍，釋放水解酶及活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）降解生物材料，同時釋放大量細胞因子和趨化因子如CXC 基序趨化因子配體8（CXC che-mokine ligand 8，CXCL8），CC 基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2），CC 基序趨化因子配體4（C-C motif chemokine ligand 4，CCL4）招募并激活單核細胞分化為巨噬細胞。激活的巨噬細胞進入局部微環(huán)境后，識別纖維蛋白并粘附在生物材料表面，對生物材料進行吞噬或融合形成異物巨細胞一同參與生物材料的降解［21］。急性炎癥期后，單核/巨噬細胞數(shù)量減少，同時適應(yīng)性免疫細胞如T 細胞進入，膠原沉積，纖維形成，進入異物反應(yīng)的慢性炎癥及纖維包裹期［22］。

巨噬細胞在異物反應(yīng)過程中起到了重要作用，不僅通過吞噬作用或釋放生物活性因子對植入材料進行持續(xù)的降解，同時會持續(xù)釋放趨化因子招募更多的單核/巨噬細胞。與創(chuàng)口愈合相似，粘附的巨噬細胞最終會向M2 型轉(zhuǎn)換，分泌抗炎細胞因子如IL-10，促進膠原沉積和纖維形成。巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)換或吞噬作用受阻后，會通過細胞膜的融合形成異物巨細胞共同參與對生物材料的降解。釋放的生物活性因子及降解碎片會改變局部免疫微環(huán)境［23-24］。

隨著對機體與生物材料的深入理解，研究者認識到免疫系統(tǒng)是生物材料介導(dǎo)的功能組織再生的重要參與部分［25］。免疫系統(tǒng)是一個具有多向調(diào)節(jié)功能的系統(tǒng)。由于生物材料可以介導(dǎo)局部免疫反應(yīng)，并且通過改變生物材料機械性能、理化性能等調(diào)控其引發(fā)的免疫反應(yīng)［26-30］。因此，對再生生物材料的研發(fā)思路應(yīng)該從傳統(tǒng)的免疫抑制的研發(fā)思路轉(zhuǎn)變?yōu)橐龑?dǎo)積極有利的免疫反應(yīng)。

良好的免疫反應(yīng)可以促進成骨、介導(dǎo)合適的屏障膜降解速度，而不當?shù)拿庖叻磻?yīng)可能會導(dǎo)致持續(xù)的炎癥，加速屏障膜降解，影響骨再生進程［31］。這說明了創(chuàng)造良好局部免疫微環(huán)境的重要性，然而這一調(diào)控作用和機制常常被忽視。忽略屏障膜對局部免疫微環(huán)境的調(diào)控作用不利于創(chuàng)造促進骨組織再生的微環(huán)境，對骨再生進程產(chǎn)生不良影響。因此，需要深入理解屏障膜的免疫調(diào)控性能，并使其獲得有利于骨組織再生的骨免疫調(diào)控性能與降解性能。

2.1 免疫微環(huán)境與骨再生

研究者們認識到骨再生過程不僅只有骨相關(guān)細胞及骨骼系統(tǒng)參與，而是一個多系統(tǒng)、多細胞共同參與的過程［22］。如今，骨免疫學(xué)領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注，它將免疫反應(yīng)視為骨骼愈合過程中的必要過程，而且還強調(diào)了免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)的密切關(guān)系。

機體的骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共享多個細胞、細胞因子、受體、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子，使兩個系統(tǒng)之間相互聯(lián)系、相互影響。免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)中共享的核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/核因子κB 受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）信號軸證實了兩個系統(tǒng)之間的直接聯(lián)系［32］。免疫細胞在調(diào)節(jié)骨骼動力學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，而早期的免疫環(huán)境決定了再生結(jié)果。因此，成功的骨再生需要良好的骨免疫環(huán)境，具有良好的骨免疫調(diào)節(jié)性能的材料可以介導(dǎo)有利的骨免疫微環(huán)境，促進骨組織再生。機體骨組織的穩(wěn)態(tài)主要由成骨與破骨活動的平衡維持。在病理狀況下，由于機體成骨活動與破骨活動的平衡被打破，可能會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨溶解、骨硬化癥等疾病［33］。免疫細胞能夠分泌多種細胞因子如炎性細胞因子［腫瘤壞死因子-α（tu-mor necrosis factor-α，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白介素-17（interleukin-17，IL-17）］、成骨相關(guān)細胞因子［骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］及破骨相關(guān)細胞因子［巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF），RANKL，OPG 參與調(diào)節(jié)機體的骨組織代謝平衡。這些細胞因子在不同的濃度和作用時間下對骨組織代謝起雙重調(diào)節(jié)的作用［34］。傳統(tǒng)觀點認為炎性細胞因子可能會導(dǎo)致骨吸收。近來的研究表明，早期階段炎性細胞因子在生理濃度范圍內(nèi)能夠促進血管化，加速壞死組織、代謝產(chǎn)物的排出，介導(dǎo)合適的骨免疫微環(huán)境誘導(dǎo)礦化基質(zhì)的產(chǎn)生［15］。同時研究者們發(fā)現(xiàn)，生理濃度的BMP-2 具有良好的促成骨作用［35］，而高濃度的BMP-2 會抑制新生骨形成［36-37］。

由于骨組織持續(xù)地新陳代謝，功能性骨組織的改建必然伴隨著破骨細胞活動。M-CSF、RANKL及OPG 是免疫細胞參與調(diào)節(jié)破骨細胞形成的三個主要關(guān)鍵細胞因子［38］。早期未成熟的增殖性單核-吞噬細胞被稱為破骨細胞的前體。在骨重塑期間M-CSF 和RANKL 等信號因子的刺激下，巨噬細胞發(fā)生融合并最終分化為破骨細胞。成骨細胞可以分泌M-CSF，M-CSF 不僅參與了巨噬細胞和破骨細胞的增殖、分化和遷移，同時也是維持成熟破骨細胞功能活動所必需的細胞因子。機體主要通過RANKL/RANK 途徑調(diào)控破骨細胞的活性。RANKL主要在成骨細胞、活化的T 細胞和中性粒細胞中表達，能夠與破骨前體細胞RANK 表面受體結(jié)合以調(diào)節(jié)破骨細胞功能活動［39］。此外，活化的T 細胞還能夠分泌多種細胞因子參與骨組織重塑。有研究表明，CD4+T 輔助細胞如Th1（I 型T 輔助細胞）及Th2（II 型T 輔助細胞）分別能夠產(chǎn)生IFN-γ 和IL-4，兩者均顯示出抑制破骨細胞功能的作用［40］。其中，IFN-γ 可以誘導(dǎo)RANK 銜接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor-associated factor 6，TRAF6）快速降解，從而抑制RANKL 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 及Jun N 末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）的激活。因此，T 細胞對破骨細胞的作用取決于T 細胞分泌的多種細胞因子之間的平衡。盡管被募集到損傷部位的活化T 細胞在成骨細胞成骨向分化中主要起抑制作用，但在炎癥后期組織重塑階段，T 細胞被證實能夠分泌成骨相關(guān)因子促進新骨形成，加速骨組織再生［41］。OPG 主要由骨骼的成骨細胞以及免疫系統(tǒng)中的B 細胞表達，OPG是RANKL 的誘餌受體，能夠與RANKL 結(jié)合，從而阻斷RANKL/RANK 的相互作用，防止骨骼過度吸收［38］。有研究顯示，在骨缺損愈合過程中，B 細胞的數(shù)量超過T 細胞，被募集的B 細胞被證實能夠通過提高OPG 的局部濃度下調(diào)破骨細胞活性，從而促進骨骼形成［42］。這意味著T 細胞和B 細胞共同參與了對破骨細胞的調(diào)控［43］。

在所有免疫細胞中，巨噬細胞由于在骨骼愈合過程中的多重作用和高可塑性而受到廣泛關(guān)注。巨噬細胞在機體炎癥及固有免疫反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用。基于其獨特的功能特性、表面標志物和誘導(dǎo)劑，巨噬細胞已被廣泛表征為M1 和M2 表型。經(jīng)典激活的M1 型巨噬細胞會分泌多種促炎細胞因子（TNF-α，IL-6，IL-1b）誘導(dǎo)破骨細胞生成并增強破骨細胞活性，從而導(dǎo)致骨吸收。替代激活的M2 型巨噬細胞通過釋放抑炎細胞因子（IL-4，IL-10，IL-13）參與組織修復(fù)的后期［44］。體內(nèi)外實驗表明，在炎癥中晚期，M2 型巨噬細胞不僅會分泌成骨相關(guān)因子（BMP-2 和VEGF）促進骨再生，同時還會分泌炎癥和纖維化相關(guān)因子（TNF-α，TGF-β1，TGF-β3）促進病理性纖維化導(dǎo)致纖維包裹［45-46］。

巨噬細胞的表型會根據(jù)微環(huán)境的變化而發(fā)生動態(tài)變化，同時，巨噬細胞分泌的炎性細胞因子和基因表達也會由于表型的改變而變化，這個特性決定了它能夠參與到骨愈合過程的各個階段，從而影響局部免疫微環(huán)境。在急性炎癥期，被募集到損傷區(qū)域的巨噬細胞通常表現(xiàn)為M1 型，通過趨化因子及促炎細胞因子的釋放，協(xié)同募集更多的免疫細胞及間充質(zhì)干細胞參與到缺損修復(fù)中。此后，隨著局部炎癥的消退，巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型，分泌有助于細胞增殖分化和細胞外基質(zhì)沉積的細胞因子（IL-4，IL-10 和TGF-β），參與缺損部位的再生及修復(fù)。持續(xù)較強的M1 型反應(yīng)及M2 型反應(yīng)縮短減弱導(dǎo)致嚴重的異物反應(yīng)和慢性炎癥，延遲組織愈合，最終導(dǎo)致生物材料整合的失敗［47］。而合適的M1 型向M2 型的表型轉(zhuǎn)換，有利于中后期M2 型巨噬細胞分泌促成骨相關(guān)因子，促進新骨再生［48］。有團隊針對巨噬細胞在骨缺損修復(fù)再生中的表型轉(zhuǎn)換，研發(fā)了具備良好免疫調(diào)節(jié)特性的仿生分層纖維內(nèi)礦化膠原蛋白。該材料實現(xiàn)了對骨缺損再生中巨噬細胞表型的管控，顯著增強了間充質(zhì)干細胞成骨分化及骨組織再生［49］。因此，對巨噬細胞的深刻理解，特別是對免疫細胞因子釋放和M1-M2 極化的正確調(diào)控，將為骨組織再生提供有效的調(diào)控途徑。

2.2 免疫微環(huán)境與屏障膜的降解

使用可吸收屏障膜進行GBR 時，需要使用屏障膜阻擋軟組織的長入，并持續(xù)至少4 周的時間允許成骨細胞的長入和分化。屏障膜過早的坍塌降解會使其失去屏障功能，導(dǎo)致組織再生的失敗，而降解時間過長，反過來可能會增加屏障膜暴露及感染風(fēng)險［14］。因此，良好的屏障膜降解性能能夠介導(dǎo)有利于骨組織再生的局部微環(huán)境。

由于不同類型、大小及不同病因所致的牙槽骨缺損所需的愈合再生時間不同，因此需要可吸收屏障膜具有可控的降解速率以支持不同類型的牙槽骨組織再生。針對屏障膜的降解性能，已有大量團隊針對其理化性能，如通過改變理化溶解、水解、酶解或腐蝕速度等方式調(diào)節(jié)屏障膜降解速度［50］。交聯(lián)法是最常用的針對屏障膜降解性能的理化改性方法，并且已成功用于改善屏障膜機械性能和酶解速度。有研究使用天然交聯(lián)劑京尼平優(yōu)化靜電紡絲殼聚糖納米纖維，取代了傳統(tǒng)有機溶劑三氟乙酸，避免了殼聚糖氨基之間氫鍵的破壞及斷裂，從而顯著改善了其機械強度，有效減緩了屏障膜降解速度。體外實驗顯示，未交聯(lián)的膜通常在4 周后降解，但交聯(lián)后的屏障膜在4～6 個月中仍能夠保持膜的完整性，維持屏障功能［50］。然而，盡管通過交聯(lián)改性的屏障膜能夠維持更長的屏障時間，但交聯(lián)劑的引入會使屏障膜在降解過程中引發(fā)更強且更持久的宿主炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致更重的異物反應(yīng)進而干擾骨組織再生進程［51］。

在屏障膜降解過程中，細胞介導(dǎo)的降解在生物材料降解中起到了重要作用，其中巨噬細胞和異物巨細胞（foreign body giant cells，F(xiàn)BGCs）是參與生物材料降解的關(guān)鍵細胞。有研究表明，當植入顆粒小于5 μm 時，巨噬細胞可以通過吞噬作用降解材料；當材料顆粒大于10 μm 時，由于吞噬作用受阻，巨噬細胞會融合形成FBGCs 進而提高其吞噬能力［21］，同時FBGCs 通過釋放活性氧，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等降解酶協(xié)助參與植入材料的降解［25］。然而，目前細胞介導(dǎo)的屏障膜降解機制尚不清楚。因此，需要了解細胞介導(dǎo)的屏障膜降解的免疫調(diào)節(jié)機制，以更好地調(diào)控屏障膜降解性能。

3 基于“免疫微環(huán)境調(diào)控”理念的屏障膜應(yīng)用研發(fā)

基于“免疫微環(huán)境調(diào)控”理念，用于GBR 的屏障膜不應(yīng)被簡單地視為被動的物理屏障，而應(yīng)視為具有免疫調(diào)控能力的生物活性屏障。現(xiàn)有的屏障膜在屏障性能上無法滿足臨床需求，同時無法為骨生成和重塑提供最佳的微環(huán)境。針對屏障膜的兩個關(guān)鍵問題，本課題組將“免疫微環(huán)境調(diào)控”的研發(fā)理念應(yīng)用于改善屏障膜的降解及促成骨性能上，成功研發(fā)出具有骨免疫調(diào)控性能的新型屏障膜和具有可控免疫降解性能的新型屏障膜，不僅有效地建立了屏障膜的屏障作用，并且通過調(diào)控巨噬細胞的活化狀態(tài)和極化方向創(chuàng)造了促進成骨的免疫微環(huán)境，證實了靶向調(diào)控巨噬細胞介導(dǎo)的骨免疫微環(huán)境，是優(yōu)化膠原膜屏障功能和骨免疫調(diào)控性能，從而有效提高屏障膜介導(dǎo)的GBR 修復(fù)效果可行的研發(fā)方向。

3.1 通過機械性能及理化性能修飾后具有良好骨免疫調(diào)控性能的屏障膜

本課題組發(fā)現(xiàn)，將臨床常用的可吸收性膠原膜植入體內(nèi)后，機體會產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答，同時膠原膜光滑面和粗糙面因為表面結(jié)構(gòu)不同呈現(xiàn)不同的免疫應(yīng)答［52］。膠原膜粗糙面組織會形成明顯的單核細胞浸潤帶，通過免疫組織化學(xué)分析證實這一密集單核細胞浸潤帶以巨噬細胞為主。同時，體外實驗也證明膠原膜不僅能促進巨噬細胞分泌促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18），還能通過釋放成骨相關(guān)細胞因子［BMP-2，BMP-6、Wnt-10b 和抑瘤素M（oncostatin M，OSM）］促進間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化，證實了膠原膜的有效骨免疫調(diào)控作用。因此，通過賦予屏障膜調(diào)控巨噬細胞極化、表型轉(zhuǎn)換和局部免疫微環(huán)境的良好性能，從而研發(fā)具有良好骨免疫調(diào)控作用的屏障膜，可能是提高GBR 療效的一個有效策略。

為了優(yōu)化屏障膜的骨免疫調(diào)控性能，本課題組采用脈沖激光沉積技術(shù)于膠原膜表面均勻地涂布Ca2ZnSi2O7生物活性玻璃涂層。覆蓋Ca2ZnSi2O7涂層的膠屏障膜在與巨噬細胞相互作用的過程中，緩慢地釋放鈣、鋅和硅離子，刺激巨噬細胞上TNF-α 下調(diào)、IL-1β 上調(diào)，抑制炎性介質(zhì)TNF-α，血清環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iN-OS）的基因表達和巨噬細胞中NO 和IL-6 的產(chǎn)生，同時，提高成骨相關(guān)因子如BMP-2，BMP-6，WNT-10b 及OSM 的表達，賦予了屏障膜優(yōu)秀的骨免疫調(diào)控性能，有效促進成骨分化［52］。

此外，通過調(diào)控屏障膜機械性能、理化性能，引入生物活性分子、金屬離子、生長因子、抗生素等［53-57］，同樣會影響巨噬細胞的活化狀態(tài)與極化方向，賦予屏障膜良好的骨免疫調(diào)控性能（圖1）。有研究表明，負載有免疫相關(guān)因子如IL-4 的膠原膜可以通過釋放免疫因子，促進抑炎因子的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)，加速炎癥的消除［53］。有研究通過表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）交聯(lián)修飾膠原膜，使其具有更好的機械性能和生物活性，同時可以下調(diào)促炎因子的表達，通過募集M2 型巨噬細胞，促進VEGF 和BMP-2 的分泌，上調(diào)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（runt related transcription factor-2，RUNX-2）和OPG 的表達，該研究在EGCG 改性膠原膜中發(fā)現(xiàn)了厚而有序的新骨形成［54］。此外，EGCG 交聯(lián)的膠原膜還能夠通過募集M2 型巨噬細胞，促進生長因子的分泌和成骨分化，從而改善FBR，促進體內(nèi)骨再生［24］。有研究通過向絲素蛋白摻入硫酸軟骨素構(gòu)建了具有微孔結(jié)構(gòu)的混合膜，該膜表現(xiàn)出了更好的機械性能和更高的親水性，同時能夠下調(diào)促炎細胞因子的表達，上調(diào)成骨相關(guān)因子，通過抑制巨噬細胞的炎癥反應(yīng)，抑制破骨細胞生成以增強成骨作用。實驗結(jié)果表明，SrCS/SF 復(fù)合膜具有良好的骨免疫調(diào)節(jié)特性［55］。聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）是一種可生物吸收和生物相容的聚酯材料，在臨床骨缺損修復(fù)具有廣泛的應(yīng)用。有研究使用S-亞硝基谷胱甘肽和人骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體對PCL 屏障膜進行修飾改性后，觀察到炎性細胞因子如IL-6，TNF-α，iNOS 和IL-1β 等基因表達發(fā)生顯著變化，證實該膜可顯著減輕炎癥，同時促進了間充質(zhì)干細胞的成骨分化［56］。有學(xué)者在嚙齒動物顱骨缺損中植入載有阿奇霉素的PCL 膜，不僅賦予了屏障膜良好的抗感染能力，同時改善了骨愈合過程中的巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換，促進骨組織再生［57］。

3.2 具有良好“免疫降解”性能的屏障膜

延長膜耐用性的傳統(tǒng)策略能夠提高其抵抗理化溶解和酶溶解的能力，但也會引起更強烈的炎癥反應(yīng)及更高的感染風(fēng)險。相反，操縱細胞介導(dǎo)的降解過程不僅能夠改善屏障膜降解性能同時不會犧牲材料的生物相容性。因此，通過調(diào)控細胞介導(dǎo)的降解以達到一個最佳的平衡點可能是一個優(yōu)化屏障膜降解性能的有效策略。

本課題組將膠原膜植入機體后，可以觀察到大量巨噬細胞浸潤，試圖侵入植入的膠原基材料。但直到FBGC 出現(xiàn)，膠原膜才顯示出分解的跡象。實驗結(jié)果顯示，巨噬細胞融合形成的異物巨細胞介導(dǎo)的降解在膠原膜降解過程中起到了關(guān)鍵作用［58］，該現(xiàn)象也得到了相關(guān)研究結(jié)果的證實［59］。

膠原膜的植入會誘導(dǎo)T 淋巴細胞向Th2 分化，同時上調(diào)IL-13 的表達，誘導(dǎo)巨噬細胞在屏障膜植入處形成FBGC 區(qū)。本課題組通過中和巨噬細胞融合誘導(dǎo)劑IL-13，抑制了FBGC 的形成，同時有效延緩了膠原膜的降解。這證實了通過“免疫降解”策略調(diào)節(jié)細胞介導(dǎo)的降解，可有效延緩膠原膜降解速度，從而大大延長膠原膜的屏障功能。此外，操縱其他潛在的巨噬細胞融合誘導(dǎo)劑，例如IL-4和瞬時受體電位香草酸受體4（transient receptor po-tential cation channel subfamily V member 4，TRPV4），以及其他參與屏障膜降解的中性粒細胞、T 細胞等免疫細胞也可能是開發(fā)具有優(yōu)異降解性能屏障膜的可行策略［60-61］（圖2）。

有研究通過天然的核糖交聯(lián)劑作為化學(xué)交聯(lián)的替代方法，制備了具有穩(wěn)定致密結(jié)構(gòu)的膠原膜，能夠抑制免疫細胞的浸潤，實現(xiàn)屏障膜降解時間的延長［62］。改變屏障膜的孔徑、表面形貌等會導(dǎo)致局部微環(huán)境改變［63］，由于巨噬細胞具有高可重塑性，能夠根據(jù)微環(huán)境的變化而動態(tài)變化，因此筆者推測，通過改變屏障膜理化性能實現(xiàn)對局部免疫微環(huán)境的調(diào)控可以對巨噬細胞的吞噬和融合功能產(chǎn)生影響，進而實現(xiàn)對細胞介導(dǎo)的屏障膜降解的調(diào)控。然而，目前國內(nèi)外學(xué)者針對“免疫降解”策略進行的屏障膜相關(guān)研究較少。

4 小結(jié)及展望

目前，牙槽骨缺損是口腔中常見的臨床問題，具有發(fā)病率高、危害大的特點。研發(fā)具有良好成骨效能的屏障膜，促進引導(dǎo)骨再生治療效果具有重要的科學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。傳統(tǒng)屏障膜的研發(fā)策略集中關(guān)注其物理屏障功能、降解性能及如何限制免疫不良反應(yīng)。然而，屏障膜不僅能夠被動地阻擋結(jié)締組織，還能夠調(diào)控巨噬細胞極化并介導(dǎo)促炎和抑炎微環(huán)境的平衡。因此，針對屏障膜的研發(fā)更應(yīng)關(guān)注其與多系統(tǒng)、多細胞相互作用后免疫微環(huán)境的改變。這一轉(zhuǎn)變，對屏障膜的研發(fā)提出了更高要求，需要其滿足臨床迫切需求的同時有利于調(diào)控骨再生及自身降解性能的局部免疫微環(huán)境。

通過離子摻入，化學(xué)交聯(lián)及復(fù)合材料等方式能夠改變屏障膜的機械性能及理化性能，實現(xiàn)對屏障膜植入微環(huán)境中免疫細胞尤其是巨噬細胞的調(diào)控，進而改變局部免疫微環(huán)境影響骨再生及屏障膜降解進程。要實現(xiàn)有利于骨再生及屏障膜降解的局部免疫微環(huán)境構(gòu)建，需要深刻了解屏障膜機械性能及理化性能的改變對免疫細胞的作用。然而，生物材料理化表面及機械性能對免疫細胞的調(diào)控機制尚未徹底明晰，屏障膜的降解過程亦未完全探明。此外，研究者必須認識到人類的基因背景與鼠或其他哺乳類動物存在明顯差異，因此在不同物種之間對生物材料的骨免疫特性進行研究時，應(yīng)該注意到免疫學(xué)標志物在人-鼠等不同物種間的差異，這也是部分研究無法重復(fù)，難以實現(xiàn)有效臨床轉(zhuǎn)化的重要原因。基于此，為開發(fā)新一代具有良好“免疫微環(huán)境調(diào)控”性能的屏障膜，未來研究需要從“免疫微環(huán)境”角度著手，揭示屏障膜理化機械及表面性能對免疫細胞的調(diào)控機制及屏障膜降解過程，以提高GBR 中屏障膜成骨效能，滿足臨床骨缺損再生修復(fù)需求。

【Author contributions】 Chen ZT，Lin YX，Yang JT wrote the arti-cle. Chen ZT，Huang BX，Chen ZF revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.