胡蘿卜類黃酮含量的測定及DcCHS基因家族的鑒定分析

張新業，王雨欣，孫艷香，朱 姝，王聰艷，李文靜

(1.廊坊師范學院 生命科學學院，河北廊坊 065000；2.河北省動物多樣性重點實驗室，河北廊坊 065000； 3.廊坊市細胞工程與應用研究重點實驗室，河北廊坊 065000)

類黃酮(flavonoids)，又稱黃酮類化合物，是一類重要的植物次級代謝產物，包括查爾酮(chalcones)、黃酮(flavones)、黃酮醇(flavonols)、花青素(anthocyanins)等[1]。類黃酮具有廣泛的生理作用，能夠參與植物色素的形成[2-3]，協助植物抵御非生物脅迫，并調節植物生長發育[4]。此外，類黃酮還具有一定的藥理功能，如抗氧化、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等[5]。因此，植物類黃酮的研究越來越受到重視。

查爾酮合成酶(chalconesynthase,CHS)屬于植物聚酮合酶超家族[6]，是類黃酮合成過程中的第一個關鍵酶，能夠催化三分子丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)與一分子香豆酰輔酶A(p-Coumaroyl-CoA)縮合形成柚皮素查耳酮(naringeninchalcone)，該產物是其他黃酮類物質合成的基礎[7-8]。CHS基因首次從歐芹細胞培養物中獲得[9]。近年來，隨著基因組測序技術和生物信息學的發展，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)[10]、番茄(Solanumlycopersicum)[11]、辣椒(Capsicumannuum)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]、玉米(Zeamays)[14]和香蕉(Musaacuminate)[15]中的CHS基因家族被陸續鑒定。由于物種的不同，CHS基因家族成員的數目會有所差異。盡管如此，不同物種來源的CHS基因在結構上較為保守，通常含有兩個外顯子和一個內含子，外顯子1可編碼37～64個氨基酸殘基，外顯子2編碼約340個氨基酸殘基[16]。此外，分子進化可能會引起CHS基因的內含子數目發生變化[17]。CHS基因表達量的改變不僅能夠影響類黃酮的含量，而且可以調節植物花色、育性及抗逆性。Sun等[18]在矮牽牛(Petuniahybrida)中過表達香雪蘭(Freesiahybrida)CHS基因，使矮牽牛的類黃酮含量及花色均發生改變。邵莉等[19]研究表明，矮牽牛中CHS基因的轉錄被抑制后，不僅影響花色，還可導致雄性不育。Chen等[20]在煙草(Nicotianatabacum)中過表達紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)EaCHS1基因，除可提高煙草的類黃酮含量外，還增強了其抗鹽能力。

胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)屬傘形科，是一種塊根作物，具有重要的經濟價值[21]，其營養豐富，含有大量的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，是維生素K和維生素B6的良好來源[22]。到目前為止，胡蘿卜CHS基因家族還未見報道。胡蘿卜基因組測序的完成，為在全基因組水平上研究其CHS基因家族奠定基礎。本研究測定不同發育時期胡蘿卜根和葉中類黃酮的含量，同時利用生物信息學的方法鑒定胡蘿卜CHS基因家族，并對其進行染色體定位、基因結構、進化樹構建等分析，可為進一步研究CHS基因家族在胡蘿卜類黃酮代謝過程中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 類黃酮含量測定

胡蘿卜品種‘橘紅一號’種子經浸種后，種植于混合基質[V(蛭石)∶V(營養土)=1∶1]中，置于人工氣候室內(25 ℃光照14 h，18 ℃黑暗 10 h，光照強度為240 μmol·m-2·s-1)進行培養。于苗期和收獲期分別采集胡蘿卜的根和葉， 105 ℃殺青15 min，70 ℃烘干至恒量。將烘干的胡蘿卜組織粉碎，過40目篩，稱取約0.05 g樣品，加入1 mL含量為60%的乙醇，60 ℃超聲提取30 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用相同濃度的乙醇溶液定容至1 mL，即為樣品待 測液。

利用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進行類黃酮含量的測定(北京迪信泰檢測科技有限公司)。取60 μL樣品待測液于1.5 mL離心管中，加入 15 μL含量5%的亞硝酸鈉溶液，混勻，室溫靜置 5 min；加入15 μL質量分數為10%的硝酸鋁溶液，混勻，室溫靜置5 min；加入120 μL含量為4%的氫氧化鈉溶液和90 μL含量為60%的乙醇溶液，混勻，37 ℃水浴45 min，10 000 g離心10 min，取200 μL上清于微量比色皿中測定470 nm處吸光度，以蒸餾水作為空白對照。類黃酮含量表示為 mg·g-1。

以蘆丁為標樣制作標準曲線。稱取蘆丁 1 mg，加入含量為60%的乙醇溶液配制成 0.036 mg·mL-1、0.024 mg·mL-1、0.016 mg·mL-1、0.008 mg·mL-1和0.004 mg·mL-1的標準溶液，測定方法同上。

1.2 胡蘿卜CHS基因家族成員的鑒定

胡蘿卜基因組序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.dna.toplevel.fa)、CDS序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.cds.all.fa)、蛋白質序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.pep.all.fa)及gff3數據格式文件(Daucus_carota.ASM162521v1.42.gff3)等均下載自EnsemblPlants數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)。

在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)中以“chalcone synthase”作為關鍵詞進行檢索，獲得CHS蛋白保守結構域Chal_sti_synt_N及Chal_sti_synt_C的Pfam號PF00195和PF02797，下載各Pfam號對應的隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Model,HMM)文件(Chal_sti_synt_N.hmm和Chal_sti_synt_C.hmm)。利用hmmsearch程序將兩個HMM文件在胡蘿卜蛋白質序列文件中進行檢索，并將兩個HMM文件的檢索結果合并，剔除無完整讀碼框的序列，同時具有Chal_sti_synt_N和Chal_sti_synt_C兩個結構域的蛋白即為胡蘿卜CHS蛋白，然后利用NCBI數據庫中CD-Search工具對篩選到的胡蘿卜CHS蛋白進行進一步確認。利用perl程序從胡蘿卜蛋白質序列文件中提取CHS基因家族各成員的蛋白序列，使用在線工具ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對胡蘿卜CHS蛋白的氨基酸序列進行等電點分析及分子質量預測等。

1.3 胡蘿卜CHS基因的結構及染色體定位分析

從gff3文件中獲得胡蘿卜CHS基因外顯子和內含子在染色體上的位置信息，并利用工具GSDS(Gene Structure Display Server)繪制基因結構圖[23]。

利用perl程序從胡蘿卜gff3文件中獲取CHS基因家族在染色體上的位置信息，然后根據相應染色體的長度信息，利用MapChart繪制CHS基因的染色體定位圖[24]。

1.4 胡蘿卜CHS蛋白性質分析

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SignalP 4.1 Server[25](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和CELLO v.2.5[26](http://cello.life.nctu.edu.tw/)對胡蘿卜CHS蛋白的二級結構、信號肽、跨膜區和亞細胞定位情況進行預測 分析。

1.5 胡蘿卜CHS蛋白的結構分析及系統進化樹構建

使用DNAMAN對鑒定到的胡蘿卜CHS蛋白進行多序列比對，并利用MEGA6軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建胡蘿卜CHS蛋白的系統發育進化樹，bootstrap設置1 000次重復，其他參數均使用默認設置[27]。使用MEME軟件在胡蘿卜CHS蛋白序列中搜索保守基序，將參數中的預測數目設置為10，長度設置為 6～100，其他參數均為默認設置，同時利用PfamScan(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/)對鑒定到的保守基序進行注釋[15]。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜不同組織部位的類黃酮含量測定

測定不同濃度蘆丁標準樣品在470 nm處的吸光度，以蘆丁濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標，進行標準曲線的繪制。求得回歸方程為y=11.564x-0.008 1，決定系數R2= 0.999 1，表明標準曲線的擬合度較高(圖1-A)。

類黃酮含量的測定結果表明，苗期胡蘿卜根和葉中的類黃酮含量分別為3.99 和19.69 mg·g-1，收獲期根和葉中的類黃酮含量分別為3.50和19.60 mg·g-1。無論在苗期還是收獲期，葉中的類黃酮含量均高于根中的含量，且達到極顯著水平(P<0.01)。葉中的類黃酮含量在不同發育時期差異不顯著，而根中的類黃酮含量在不同發育時期差異顯著(P<0.05)(圖1-B)。

2.2 胡蘿卜CHS基因家族的鑒定

利用生物信息學的方法，從胡蘿卜基因組中鑒定到12個CHS基因家族成員，命名為DcCHS1～DcCHS12。分析家族成員的序列發現，氨基酸序列長度為253～398 aa，其中DcCHS4及DcCHS5的氨基酸序列最長，DcCHS10最短；DcCHS蛋白分子質量為26.91～44.00 ku，等電點為5.13～7.13。DcCHS基因的外顯子為1～3個，內含子為0～2個(表1，圖2)。

從CHS基因在胡蘿卜基因組中的分布看，除DcCHS12未被定位到染色體上外，其余11個成員分布于胡蘿卜的5條染色體上。5號染色體上的基因數目最多(5個)，4和6號染色體上的基因個數最少(1個)，7號和9號染色體上均有2個基因。這表明CHS基因家族成員分布并不均勻，DcCHS2～6具有明顯的成簇分布現象[28](圖3，表1)。

2.3 胡蘿卜CHS蛋白的結構分析

胡蘿卜CHS蛋白的二級結構主要以α-螺旋和無規卷曲為主，分別占38.34%(DcCHS10)～ 48.34%(DcCHS9)和30.39%(DcCHS8)～ 36.80%(DcCHS2)；伸展鏈和β-轉角的占比較低，分別為13.81%(DcCHS9)～19.37%(DcCHS10)和5.63%(DcCHS9)～8.70%(DcCHS10)。經預測，胡蘿卜CHS蛋白不含信號肽及跨膜區，且均定位于細胞質中(表2)。對各成員的氨基酸序列進行多序列比對，結果表明DcCHS1、DcCHS8和DcCHS10的N端存在大片段缺失，其他成員間序列長度差異不大(圖4，表1)；DcCHS7和DcCHS10之間一致性最低為 25.32%，而DcCHS4和DcCHS5的序列完全一致，可能是同一基因的兩個拷貝(表3)。此外，各成員均含有CHS蛋白的催化位點、底物特異性殘基、丙二酰輔酶A結合位點及CHS特征序列[18](圖4)。

表1 胡蘿卜CHS基因家族成員信息Table 1 Information of CHS gene family in carrot

表2 胡蘿卜CHS蛋白的結構分析Table 2 Structure analysis of CHS protein in carrot

表3 CHS基因家族的氨基酸序列一致性Table 3 Identity of amino acid sequences of CHS gene family in carrot

2.4 胡蘿卜CHS蛋白系統發育及蛋白保守基序分析

為明確胡蘿卜CHS基因家族成員間的進化關系，利用CHS基因家族的蛋白序列構建系統發育進化樹。胡蘿卜CHS蛋白被分為兩類：ClassⅠ和ClassⅡ，除DcCHS7、DcCHS12屬于ClassⅡ外，其余成員均屬于ClassⅠ。此外，ClassⅠ還可以被進一步劃分為兩個亞類：SubclassⅠ和SubclassⅡ(圖5-A)。

利用MEME軟件對胡蘿卜CHS蛋白進行保守基序分析，并對鑒定到的保守基序進行功能注釋。在胡蘿卜CHS蛋白中共鑒定到10種保守基序，分別命名為motif1～motif10，其中motif1、4、6、7均為CHS蛋白N端結構域，motif2、3、8均為CHS蛋白C端結構域，motif3含有丙二酰輔酶A結合部位及CHS特征序列(圖5-B)。DcCHS7和DcCHS12所含motif的種類相同，DcCHS4、DcCHS5、DcCHS6、DcCHS9所含motif的種類相同，盡管不同家族成員的蛋白序列中所包含的保守基序的種類及數量有所差異，但所有成員均含有CHS蛋白的N端和C端結構域(圖5-A)。

3 討 論

胡蘿卜是世界上分布廣泛的傘形科蔬菜，所含的黃酮類化合物(如山奈酚、槲皮素和木犀草素)使其具有較好的抗氧化、抗癌作用，并能調節免疫反應及減輕炎癥損傷[29]。陳建福等[30]利用響應面法對胡蘿卜葉中類黃酮的提取工藝進行優化，得到最優提取條件：72%乙醇溶液作為提取劑，料液比為1∶15，超聲溫度和時間分別為 71 ℃和40 min，并利用NaNO2-Al(NO3)3比色法測得總黃酮含量為42.13 mg·g-1。本研究以60%乙醇作為提取劑，料液比為1∶20，60 ℃超聲提取30 min，采用同樣的方法測得苗期和收獲期葉中類黃酮的含量分別為19.69和19.60 mg·g-1，與前者結果不同，可能與提取條件及植物材料基因型的不同有關[31-32]。此外，本研究測得苗期和收獲期胡蘿卜根中類黃酮的含量分別為 3.99和3.50 mg·g-1，二者差異顯著，表明不同的測定時期也會影響類黃酮的含量[33]。

CHS是植物次生代謝產物類黃酮合成過程中的限速酶，是類黃酮代謝研究的熱點，通過調控CHS基因的表達可以有效改良類黃酮含量[34]。CHS主要以基因家族的形式存在于植物基因組中。前人已在小立碗蘚、番茄、辣椒、葡萄、玉米和香蕉基因組中分別鑒定到17、8、7、9、14和20個CHS基因家族成員[10-15]。本研究利用生物信息學的方法，從胡蘿卜基因組中鑒定到12個CHS基因家族成員。CHS基因通常含有2個外顯子和1個內含子[16]，但不同物種間CHS基因的外顯子、內含子數目會有所不同。胡蘿卜CHS基因的外顯子數為1～3個，內含子數為0～2個，與番茄[11]、辣椒[12]中的結果類似，而香蕉MaCHS03、MaCHS13基因的內含子4個，MaCHS05的內含子則多達5個[15]。DcCHS蛋白二級結構由α-螺旋、伸展鏈、β-轉角和無規卷曲構成，含量分布為α-螺旋>無規卷曲>伸展鏈>β-轉角，且全部定位于細胞質中，推測DcCHS蛋白主要在細胞質中發揮功能。香蕉中多數MaCHS蛋白的二級結構含量分布及亞細胞定位預測結果與DcCHS蛋白類似[15]。DcCHS蛋白均含有CHS的保守序列，但氨基酸水平上的序列一致性變化幅度較大，為25.32%～100%，表明成員序列之間具有較高的遺傳多樣性。此外，DcCHS蛋白大都含有CHS蛋白的催化位點、底物特異性殘基及丙二酰輔酶A結合部位等與CHS蛋白功能密切相關的位點或序列，有助于后續進一步研究胡蘿卜DcCHS蛋白的催化機理和酶活特性[6,18]。進化分析表明，胡蘿卜CHS蛋白分為兩類，與番茄[11]和辣椒[12]中的研究結果一致。CHS基因的表達及CHS蛋白的積累在轉錄水平、轉錄后水平及翻譯后水平均會受到調節[35]。CHS基因的表達通常受紫外線、植物病原菌侵染等因素的誘導，從而引起類黃酮含量的增加[6]，而參與調控的轉錄因子主要包括R2R3-MYB轉錄因子或MYB-bHLH-WD40(MBW)蛋白復合體[36]。不同植物間CHS翻譯后調節的分子機理不盡相同。在擬南芥中，含Kelch結構域的F-box蛋白-KFBCHS能夠介導CHS的泛素化降解[8]，而芍藥屬(Paeonia)植物則可通過鋅指結構蛋白-PhRING-H2使PhCHS泛素化，并介導其降解[35]。

本研究測定了胡蘿卜不同發育時期、不同組織部位的類黃酮含量，并在全基因組水平上對類黃酮合成過程中的關鍵酶基因CHS進行鑒定和分析。在后續的工作中，筆者將對DcCHS基因家族成員進行表達分析，并探明DcCHS基因表達量與胡蘿卜類黃酮含量之間的關系，以期為今后進一步研究DcCHS基因的表達調控及其在類黃酮合成過程中的作用奠定基礎。