不同種植模式對青稞根際土壤微生物群落結構的影響

姚有華,王玉林,姚曉華,安立昆, 白羿雄,李 新,吳昆侖

(1.省部共建青稞和秏牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室/西藏自治區農牧科學院，拉薩 850002； 2.青海大學 農林科學院/青海省農林科學院，西寧 810016；3.青海省青稞遺傳育種重點實驗室， 西寧 810016；4.國家麥類改良中心 青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞是青藏高原最具特色的糧食作物[1]，近年來，隨著藏民族人口的不斷增加、傳統和現代保健食品加工業的發展，對口糧及加工原料的需求旺盛，原糧價格升高，種植效益好，農牧民種植積極性高[2]。其次，青稞種植區生態保護建設和退牧還草政策的實施，使青稞成為人、畜口糧的重要雙重來源，但因農民輪作意識淡薄，連作或復種連作的現象日趨凸顯[3]。據統計，青藏高原區域內青稞常年連作面積達整個區域內青稞種植面積的38%左右，造成減產15%～25%[1]，連作嚴重威脅著青稞的穩產和豐產，減輕并解決連作造成的危害，已成為青稞生產中亟待解決的科學問題。因此，研究青稞連作障礙的發生機理，對于提出和制定合理的青稞連作障礙消減策略和技術措施，進而保障青稞可持續生產具有重要意義。

盡管連作障礙產生的原因很多，但主要來自土壤，土壤是植物進行營養吸收最直接的場所，常年連作會改變土壤的物理、化學性質及土壤酶活性，并且改變土壤微生物群落結構[4]。研究表明，小麥連作導致產量降低，全腐病增加[5]；玉米連作導致土壤理化性質惡劣，產量降低[6]；黃瓜連作導致土壤可培養微生物數量減少，根部微生物種群多樣性降低[7]；連作可導致作物地上部生長發育減弱，地下部土壤微生態環境改變，進而嚴重阻礙作物的可持續生產[8]。為消減作物連作障礙，前人從改變耕作制度入手，做了大量研究，并一致認為，輪、間和套作系統可通過維持作物根際土壤微生物群落結構的多樣性，抑制連作條件下的有害微生物增殖，進而增加有益微生物的數量和活性，提高作物產量[9]，比如，西瓜與水稻輪作[10]、甜脆豆與胡麻和小麥輪作[11]，可通過改善土壤微生態環境，減少土壤蟲害、降低作物病害；大蒜與油菜和花椒間作[12-13]，大豆與大麥輪作[14]，可通過改變土壤微生物群落結構、種群數量和多樣性進而改善土壤理化性質，最終減輕大蒜和大豆病蟲害發生率，提高產量；不同作物與黃瓜套作，可明顯提高土壤微生物群落的均勻度和多樣性指數，進而改善根際土壤微生態環境和系統[15]。綜上所述，輪作、間作和套作等多樣性栽培方式，可顯著改變作物根際土壤微生物群落結構與Alpha多樣性，進而穩定和促進土壤微生態環境和系統，從而達到有效緩解作物連作障礙的目的。因此，輪作、間作和套作等多樣性栽培模式的研究、推廣和應用，對緩解和消減作物連作障礙，進而降低病蟲危害和提高產量具有重要的理論和現實意義。

微生物種類的多樣性是維持土壤健康及監測土壤質量變化的重要指標[16]。根際微生物的群落結構、數量變化會直接影響地上植物對營養物質和水分的吸收及植物的抗逆性。截止目前，還未見有關青稞連作及多樣性栽培措施應用對青稞根際土壤微生物群落結構變化及多樣性影響的報道，雖然大量研究證明，輪作、間作、套作可以有效緩解連作障礙是與作物根系之間的地下化學作用有關[9-15]，但相關的微生態機理尚不清楚。因此，本研究利用IlluminaMiSeq高通量測序技術并結合常規方法，對比分析連作、輪作和混作3種耕作方式6種種植模式下青稞根際土壤微生物群落結構及土壤理化性質的變化規律和特征，試圖從青稞根際微生態系統角度解析其連作障礙發生的機理，以期為消減青稞連作障礙提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣區概況

采樣區位于青海省海北州門源縣北山鄉沙溝梁村的青稞高寒試驗基地(海拔為2 880 m， 37°21′56″N，101°47′5″E)；屬冷涼、濕潤的高原大陸性氣候，地處中緯度西風帶區，年均氣溫為 1.5 ℃，年平均降雨量518 mm，年蒸發量1 128 mm，無絕對無霜區；土壤質地為黑鈣土，種植作物主要以青稞、油菜、馬鈴薯為主，均為一年一熟制。

1.2 采樣區田間試驗布置

在試驗區分別選擇已連作1 a、2 a和3 a青稞的地塊和前茬為青稞、油菜、馬鈴薯的地塊各666.7 m2。于2019-04-12進行播種，除前茬為青稞的地塊設置青稞豌豆混作栽培模式外，其他地塊均設置青稞單作。青稞豌豆混作栽培播種量設定為300 kg/hm2，其中青稞播種量30 kg/hm2，豌豆播種量270 kg/hm2。施肥量：純氮31 kg/hm2，五氧化二磷35 kg/hm2；青稞單作播種量設定為300 kg/hm2，施肥量：純氮34 kg/hm2，五氧化二磷43 kg/hm2。青稞品種為‘昆侖14號’，豌豆品種為‘草原23號’，試驗均采用機械化條播，整個生育期田間管理同一般大田。

1.3 樣品采集

于2019-08-20，青稞灌漿中期(面團期)，采集連作2 a(QKA)、連作3 a(QKB)、連作 4 a(QKC)，與油菜(YC)、馬鈴薯(MLS)輪作1 a及與豌豆混作1 a(WDH) 6種種植模式下青稞植株的根際土壤。采用“抖土法”[15]，每種種植模式按“Z”字形隨機選取8個30 cm×30 cm的樣方，以青稞植株為中心，用鐵鍬挖出完整根系，抖落吸附在根系上的土壤(非根際土)，并用毛刷刷下黏在根系表面的土壤(根際土)，8個樣的非根際土和根際土分別均勻混合，均通過<2 mm的篩子，根際土保存于-80 ℃冰箱，用于后續微生物群落結構及多樣性測定，非根際土風干保存，用于后續土壤理化性質的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 土壤基本理化性質 土壤有機質含量采用重鉻酸鉀氧化—外加熱法測定[17-18]，全氮含量采用半微量凱氏法測定[17-18]，全磷含量采用硫酸—高氯酸消煮法測定[17-18]，全鉀含量采用火焰光度法測[17-18]，pH采用電位計法 (水土體積比2.5∶1)測定[17-18]。

1.4.2 根際土壤細菌與真菌測序 基因組DNA利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒進行精確定量，以確定PCR反應中DNA加入的量[19]；Miseq測序平臺V3-V4通用引物(341F/805R)已被16S rDNA PCR所用的引物融合[20]，真菌18S rDNA PCR采用 NS1-FUNG通用引物NS1和FUNGAL。PCR反應體系和擴增條件參照戴瑞卿等[19]、王秀紅等[20]的方法。由上海生工生物工程有限公司進行混合樣品的后續樣品建庫與 測序。

1.5 分析方法

1.5.1 數據分析 使用SPSS 18.0軟件對土壤理化性質及土壤微生物Alpha多樣性進行差異顯著性統計分析，先進行正態分布和方差齊性檢驗，數據符合正態分布以及方差齊性的要求后做單因素方差分析；不同處理的均值在5%的顯著性水平下做LSD多重比較 。數據以“平均數±標準差”形式表示。

1.5.2 微生物Alpha 多樣性及主坐標(PCoA)分析 參照邵宗圓等[21]的方法，計算覆蓋度(Coverage，反映測序結果是否代表樣本的真實情況)、香農指數(Shannon index，估算樣品中微生物群落多樣性)、ACE 指數(ACE index，估計樣品中微生物物種總數)、Chao1 指數(Chao1 index，估計樣品中微生物物種總數)。

真、細菌群落Beta 多樣性可以用來比較多組樣本之間的差別，利用Fast UniFrac 軟件進行主坐標分析，找出不同種植模式下的物種組成差異，并檢驗土壤微生物群落結構的分異程度 。

1.5.3 土壤群落與環境因子之間的關系分析 利用Canoco軟件進行基于線性模型的冗余分析，研究土壤理化性質與細、真菌群落之間的關系[22]。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

6種種植模式下土壤的基本理化性質見表1。結果顯示，土壤有機質為 26.95～37.24 g/kg，其中WHD模式含量最高，YC模式含量最低，呈現WHD>MLS>連作>YC的規律；全氮為 1.93～2.54 g/kg，WHD模式含量最高，QKC模式含量最低；全磷為 1.74～2.28 g/kg，YC模式含量最高，QKA模式含量最低；全鉀為 27.30～29.25 g /kg，MLS模式含量最高，QKC模式含量最低；從pH可以看出，所有土壤均屬于堿性土，其不同模式間存在顯著差異，其中YC模式pH最高，QKA和QKB模式pH最低。從表中還可以看出，有機質、全氮和全鉀隨著連作年限的增長表現出顯著降低的趨勢，而全磷則表現出隨著連作年限的增長顯著升高的趨勢。

表1 土壤理化性質Table 1 Soil physicochemical properties

2.2 根際細菌、真菌群落結構變化

2.2.1 細菌、真菌群落Alpha多樣性 由表2可以看出，6種種植模式下細、真菌測序文庫覆蓋度均達97%、99%以上，說明絕大多數細、真菌的序列均可測出，測序結果代表性較好。細菌WHD模式下Shannon 指數顯著高于連作和輪作，表現出WHD>MLS>QKA>QKB>YC>QKA的變化趨勢；真菌Shannon 指數則表現為QKC>QKB>YC>WHD>MLS>QKA的變化趨勢，且QKC模式下顯著高于其他模式。ACE 指數而言，細菌MLS模式下顯著高于其他模式，真菌無顯著差異。Chao1 指數而言，細、真菌均在MLS模式下顯著高于其他模式。本研究中，真菌Alpha多樣性均隨著連作年限的增加顯著增加，而細菌Alpha多樣性均隨著連作年限的增加顯著降低，WHD、MLS模式下細菌Alpha多樣性均高于其他模式，說明微生物種類較豐富且穩定性相對較高；YC模式下的細菌多樣性與連作相似，Alpha多樣性的改變較小。

表2 土壤細、真菌Alpha多樣性指標Table 2 Alpha diversity indexes of soil bacterial and fungi communities

2.2.2 細菌、真菌主要類群及分布 細菌屬水平樣本群落結構分布柱狀圖見圖1，可以看出根際土壤細菌主要分為Parasegetibacter、Sphingomonas、Gemmatimonas、Verrucomicrobiabacterium、Spartobacteria、Firmicutesbacterium、CitrobacterPhaeodactylibacter、Acidobacterium、Pseudomonas、Laceyella、Geobacter、Polaromonas、planctomycete、Terrimonas、Lysobacter、Exiguobacterium、Blastocatella和Povalibacter共19個類群，其中，Sphingomonas、Gemmatimonas、Firmicutesbacterium和Acidobacterium是優勢菌群，Sphingomonas屬芳香化合物降解菌，可通過降解有害芳香化合物進而保護植物。3種連作模式下，細菌主要類群相似率為89.47%，Pirellula、Aridibacter數量隨著連作年限的增加而增加，Sphingomonas數量隨著連作年限的增加而減少。WHD、MLS、YC的細菌與QKC的相似率為100%，但連作下的Unclassified、Other兩類數量與混作、輪作明顯不同，表現為WHD>MLS>YC>QKA>QKB>QKC的變化趨勢，說明連作使有益細菌數量減少，而輪、混作模式使非優勢菌群及新種數量增加。

真菌屬水平所有樣本群落結構分布柱狀圖如圖 2，可以看出6種種植模式下真菌的主要優勢菌有較大變化。主要優勢菌群為Psathyrella、Ascobolus、Auricularia、Remersonia、Microascus、Sterigmatomyces、Pleospora、Gibberella、Schizosaccharomyces、Spizellomyces、Penidiella、Rhizoctonia、Phaeosphaeria、Absidia、Hygrocybe、Macrolepiota、Pseudogymnoascus、Cryptococcus和Penicillium，QKB、QKC優勢菌群與QKA相似率分別為94.73%和78.94%，Rhizoctonia是一類對植物具有較強致病作用的真菌病害生物，6種種植模式中，Rhizoctonia豐度大小為QKC (5.43%)>QKB(5.12%)>MLS(3.83%)>QKA (3.68%)>WHD(2.98%)>YC(1.47%)。

2.2.3 細菌、真菌群落PCoA 分析 細菌群落PCoA分析結果見圖3，可以看出6種種植模式基本聚類于同一象限，表明各種植模式間變異較小，且細菌群落未發生明顯分化。細菌PCoA分析結果表明，6種種植模式下細菌群落結構的變異主要受3個主坐標成分的控制，且3個主坐標成分的解釋方差分別為97%、2%和1%，累計解釋總方差為100%。3個主坐標成分的特征值分別為 0.854、0.531、0.503，其中PC1主坐標成分的影響最大，解釋97%的變異，且主坐標成分特征值差異PC1與PC2、PC3達顯著水平(P<0.05)，說明影響6種種植模式下青稞根際土壤細菌群落結構的主導因子較明顯。

真菌群落PCoA分析結果見圖4，可以看出6種種植模式下真菌群落與細菌群落類似，同樣表現出各種植模式間變異較小且無明顯分化。真菌PCoA分析結果表明，6種種植模式下真菌群落結構的變異同樣受3個主坐標成分的控制，且3個主坐標成分的解釋方差分別為81%、9%和6%，累計解釋總方差為96%。3個主坐標成分的特征值分別為0.798、0.596、0.568，其中PC1主坐標成分的影響最大，解釋81%的變異，且主坐標成分特征值差異PC1與PC2、PC3之間達顯著水平(P<0.05)，說明影響6種種植模式下青稞根際土壤真菌群落結構的主導因子也較明顯。

2.3 細菌、真菌群落與土壤理化性質的關系

為研究影響6種種植模式下青稞根際細菌、真菌群落結構的主導環境因素，對5個土壤基本理化環境因子進行預篩選。結果表明，土壤pH、全氮(Total-N)、有機質(Organic)對細菌、真菌群落構建影響顯著(P<0.05)，由RDA雙序圖(圖5)可以看出，有機質(Organic)、全氮(Total-N)對WDH、QKA模式下的青稞根際細菌群落有正向影響，對其他4種模式下的細菌群落有負面影響，且有機質的影響大于全氮，pH則對YC、QKB青稞根際細菌群落有正向影響，對其他4種模式下的細菌群落有負面影響，環境因子間的相關關系而言，pH與有機質(Organic)、全氮(Total-N)均呈負相關關系；由RDA雙序圖(圖6)可以看出，pH、有機質(Organic)、全氮(Total-N)對WDH、YC、QKB模式下的青稞根際真菌群落有正向影響，對其他3種模式下的真菌群落有負面影響，環境因子間的相關關系而言，pH、有機質(Organic)、全氮(Total-N)均呈正相關關系。

3 結論與討論

根際土壤微生物是近年來土壤環境學研究的熱點領域，它可以顯著影響并參與植/作物的生長發育，植/作物對土壤中有效營養物質的吸收、轉運以及植/作物凋落物和殘體的分解[23]。連作、輪作、混作、套作和間作等不同種植方式和耕作制度可改變作物地下根系分泌物和地上凋落物的質和量，使根際土壤中酶和有機酸等根際活化指標發生明顯改變，進而導致根際土壤微生物群落結構和多樣性發生響應變化[23-24]。

本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術對6種種植模式下青稞根際土壤中微生物群落結構進行測序和分析。從細菌和真菌群落Alpha多樣性指數看，覆蓋度沒有明顯差異，與連作相比，WHD和MLS可顯著提高細菌群落的Shannon指數、ACE 指數和Chao1 指數；但與混作、輪作相比，連作顯著提高真菌群落的Shannon指數和ACE 指數；連作使細菌群落Alpha多樣性減小，真菌群落Alpha多樣性增加。從根際細菌、真菌屬水平樣本群落結構分布結果來看，連作模式下細菌主要類群相似率為89.47%，有害菌數量隨著連作年限的增加而增加，其中，Leptosphaeria、Tetracladium、Pleospora、Physoderma數量增加，Leptosphaeria，Pleospora 和Physoderma均為易導致植物病害的病原菌[25-26]，但在YC模式下，Pleospora數量相對連作減少 35.23%，WHD模式下Physoderma數量相對連作減少46.01%，MLS模式下Pleospora數量相對連作減少32.64%；有益菌群數量隨著連作年限的增加而減少，Sphingomonas屬芳香化合物降解菌，可通過降解有害芳香化合物進而保護植物，但其數量隨著連作年限的增加而減少，連作下的Unclassified、Other兩類數量與混作、輪作明顯不同，表現為WHD>MLS>YC>QKA>QKB>QKC的變化趨勢，說明連作使有益細菌數量減少，而輪、混作模式使非優勢菌群及新種數量增加；連作使青稞根際土壤中有害真菌數量增加，在6種種植模式中有害真菌豐度以連作最高。前人研究表明，導致連作障礙的主要原因為土壤微生物區系發生根本改變、土壤養分狀況惡化以及作物有害物質增加[27]，而作物長期連作可導致土壤微生物區系持續惡化，土壤中優勢菌群以有害真菌微生物為主，進而影響作物對土壤養分的吸收利用，致使作物生長發育不良[28-29]。本研究結果顯示，隨著連作年限增加，土壤有益菌群數量減少，有害真菌菌群成倍增加，推測真菌是造成青稞連作植障礙的主要原因，這與前人的研究結果一致[29]。大量研究表明，多樣性栽培和耕作方式如合理間作、輪作、套作等[25-26,30-33]可顯著改變土壤微生物群落結構與Alpha多樣性，進而穩定和改善土壤微生態環境[25-26,30-33]，連作后土壤微生物多樣性下降，細菌總量下降而真菌顯著上升，連作土壤由“細菌性”轉為“真菌性”土壤[34]。本研究發現，輪、混作模式可使細菌多樣性增加，土壤肥力提升，細菌中非優勢菌群及新種數量增加，對根際土壤的有害菌群具有明顯的抑制作用，連作使青稞根際土壤中微生物區系發生較大改變，導致有害菌群豐度增加，有益菌群數量減少，尤其是影響真菌菌群發生較大改變，這也與前人研究結果一致[34]。因此，本研究推測連作使青稞根際土壤由“細菌型”向“真菌型”轉化，進而導致土壤有機質和全氮含量下降，最終影響青稞的正常生長發育，而混作和合理的輪作模式可改善土壤理化性狀，進而提高青稞根際細菌群落結構多樣性及微生物群落組成，從而達到緩解青稞連作障礙的目的。

本研究通過根際細菌、真菌群落PCoA 分析結果和細菌、真菌群落與環境因子之間的關系發現，微生物群落在6種種植模式間變異較小且均未發生明顯分化，微生物群落結構受3 個主坐標成分的影響，且前兩個主坐標成分PC1、PC2的總解釋能力均大于80%，表明有顯著主導因子；細菌、真菌群落與土壤理化性質關系結果顯示，土壤pH、全氮、有機質對細、真菌群落構建影響顯著，有機質、全氮對提高WDH、QKA模式下細菌群落多樣性有正向影響，而pH、有機質、全氮對提高WDH、YC、QKB模式下的真菌群落多樣性有正向影響。前人研究表明，作物根際細菌和真菌群落結構與土壤有機碳和全氮呈正相關關系，而與土壤pH 呈負相關關系，土壤理化性質的變化可對真、細菌群落和組成產生較大影響，是真、細菌群落和組成發生較大變化的主導因素[26,30]。本研究結果表明，WDH、QKA模式下細菌群落多樣性與有機質、全氮呈正相關，WDH、YC、QKB模式下的真菌群落多樣性與pH、有機質、全氮呈正相關，結合PCoA 分析結果，可基本確定有機質、全氮和pH是影響本研究中真、細菌群落和組成發生較大變化的主導因素，這與前人研究結果較一致[30]。

本研究結果表明，與連作相比，青稞豌豆混作和馬鈴薯輪作可改善后茬青稞土壤理化性狀，進而提高青稞根際細菌群落結構多樣性及微生物群落組成，是緩解青稞連作障礙的可能途徑和主要原因，可為青稞連作障礙修復措施的制定提供科學依據。關于青稞連作障礙機理的研究，關系到青稞的可持續生產和發展。縱觀作物連作障礙研究大多集中在產生連作障礙后的緩解和修復措施，而對作物連作障礙的預防措施鮮有報道。由于作物種類和環境差異的關系，即使是同一作物，在不同的生長階段所產生連作障礙的機制可能不同，但本研究沒有進行不同生長階段的研究。本研究僅從屬水平進行了微生物種群變化的分析和鑒定，未能明確具體起作用的微生物種類，因此，下一步研究應從綱、目、科、屬、種的角度全面系統分析和鑒定微生物類群和組成，以及土壤理化性質、根際活化指標等與微生物群落和組成的相互作用及其關系，以期從青稞根際微生態系統角度解析微生物群落變化與其生長發育的關系，為消減青稞連作障礙提供理論依據和技術支撐。