Bx7OE及Dx5+Dy10優質亞基在小麥品質育種中的應用

劉 丹,梁 丹,王麗娜,朱 銘,張 明,李素敏, 胡亞南,王從磊,時曉偉,馮 剛,王建賀

(1.天津市農作物研究所，天津市農作物遺傳育種重點實驗室，天津 300384；2.周口市農業科學院， 河南周口 466000；3.唐山師范學院 生命科學系，河北唐山 063000)

中國強筋小麥育種起步較晚，近年來育成品種中大多數為中筋品種，強筋小麥品種占比較小，且推廣面積較小。目前，國內大多數強筋小麥品種品質指標與國際強筋小麥如加麥、美國DNS還有差距，不能滿足面粉企業的要求[1]。只有少部分如‘師欒02-1’‘濟南17’‘新麥26’和‘中麥578’等冬小麥品種能夠達到面粉企業的要求[2-5]。選育強筋冬小麥品種，使國內強筋小麥種植面積提高，其品質達到美國、加拿大等國強筋小麥的標準，可緩解中國優質小麥原糧過度依賴進口的難題。

天津市農作物研究所育成的春小麥品種‘津強1號’為引自加拿大的‘CSR17’的變異株系，品質達到強筋小麥標準，可替代進口強筋面粉[6]，亞基分析表明，‘津強1號’品種中含有的優質亞基Bx7OE及Dx5+Dy10，對津強系列高筋品質起到重要的作用。筆者課題組通過前期分子標記和谷蛋白SDS-PAGE分析發現，中國的冬小麥中部分品種存在Dx5+Dy10亞基，但未發現含有Bx7OE亞基的材料，因此可以通過導入Bx7OE亞基及Dx5+Dy10亞基對冬小麥品種的品質進行改良提升。

研究表明，麥谷蛋白占小麥籽粒蛋白總量的40%左右，與小麥醇溶蛋白通過蛋白質之間的相互作用形成面筋[7]，其中谷蛋白決定了面團的彈性，醇溶蛋白決定了面團的延展性和粘性[8]。谷蛋白在SDS-PAGE電泳中的遷移速率可分為高分子質量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子質量谷蛋白亞基(LMW-GS)[9-12]。高分子質量谷蛋白亞基對品質的貢獻不盡相同，對強筋品質起到了正向作用的5+10亞基為優質亞基[13-14]，而2+12對強筋品質起到了負調作用[15]；優質亞基Bx7OE研究發現，該亞基的存在使得小麥品質顯著提升，其作用機理為染色體上存在兩個串聯的Bx7亞基，兩個編碼Bx7亞基基因中存在一個逆轉座子(LTR)，改變了染色體結構，導致Bx7亞基的超量表達(Bx7OE亞基)[16- 17]。美國、加拿大優質小麥中普遍存在Bx7OE亞基，并且在育種中廣泛利用，部分國家已經將Bx7OE亞基作為主要育種目標。根據LTR逆轉座子邊界與重復片段的結合區域設計了檢測Bx7OE的STS標記，可以準確檢測Bx7OE是否存在[18]。

天津市農作物研究所小麥中心，利用‘津強1號’(谷蛋白亞基為“2*、Bx7OE+By8、Dx5+Dy10亞基”)為母本[19]、‘濟麥22’(高分子量谷蛋白亞基為null、7+8、4+12亞基)為父本進行人工雜交，用Bx7OE+8、5+10亞基替代‘濟麥22’的7+8、4+12亞基，并在F2代中篩選農藝性狀傾向于‘濟麥22’的后代，并對F3代通過STS標記對Bx7OE+8、5+10亞基進行篩選，保留Bx7OE+8、5+10亞基，以‘津強1號/濟麥22’組合為模式，探討Bx7OE+8、5+10亞基導入高產冬小麥品種，提升冬小麥品質，為后續進一步提升冬小麥品質提供理論依據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

春小麥‘津強1號’與冬小麥‘濟麥22’人工雜交的F3代，F1代種植于天津市農作物研究所大棚，F2代種植于天津市農作物有研究所云南元謀南繁基地，F3代為籽粒，水培萌發于天津市農作物研究所人工氣候培養箱。

1.2 試驗方法

F2代單穗收獲種子，每穗種子中隨機挑選3粒種子，25 ℃,12 h光照，12 h黑暗培養，萌發至一心一葉期，將3粒種子萌發的葉片混合取樣于2 mL 離心管中，液氮研磨，加入600 μL CTAB，65 ℃提取40 min，期間每10 min顛倒混勻1次；加入600 μL 氯仿，上下顛倒混勻 10 min，12 000 r/min 離心10 min；將上清液轉移到新的1.5 mL離心管中，并加入等體積的異丙醇，輕柔混勻， -20 ℃冷卻2 h，4 ℃離心，12 000 r/min，離心 10 min，棄上清，加入體積分數為70%乙醇，4 ℃， 12 000 r/min，離心10 min，通風櫥內過夜干燥，加入100 μL ddH2O，溶解DNA，-20 ℃保存。

使用2×TaqPCR Mastermix(KT201，北京，天根生化科技)，Bx7OESTS標記[20]及Dx5 STS標記[21]檢測群體的優質亞基。使用10 μL體系進行PCR擴增，其中DNA模板50 ng，正反向引物各1 μL，2×TaqPCR Mastermix 5 μL，ddH2O補足至10 μL。PCR程序為預變性 94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火58 ℃，延伸72 ℃ ，1 min，30個循環；大延伸72 ℃,5 min。15 g/L瓊脂糖，120 V，電泳40 min。

采用Excel 2016對數據進行統計，采用Powermarker[22]對標記類群進行劃分。

2 結果與分析

2.1 Bx7OE分析

對篩選農藝性狀較好且接近‘濟麥22’的F2代，進行單穗收獲，得到59份F3代，利用Bx7OE亞基產生機制所在的轉座子STS標記(TaBACl215C06-F2467和TaBACl215C06- R25515)檢測59個F3代材料，33個材料中檢測到了Bx7OE亞基(圖1)，占檢測群體的55.93%，說明Bx7OE亞基導入冬麥的比例較高。

2.2 Dx5分析

利用編碼Dx5亞基基因的STS標記(5′-CGTCCCTATAAAAGCCTAGC-3′和5′-AGTATGAAACCTGCTGCGGAC-3′)對上述59個樣本進行檢測，在41個樣本中檢測到Dx5亞基(圖2)，占總檢測樣本的69.49%，Dx5亞基導入冬麥的比例高于Bx7OE亞基。

2.3 Bx7OE亞基及Dx5亞基導入比例分析

在59個檢測樣本中，33份樣本存在Bx7OE亞基，41份樣本存在Dx5亞基，上述樣本中的27份樣本既存在Bx7OE亞基也存在Dx5亞基，占總測試樣本的45.76%。同時，存在12個樣本檢測不到Bx7OE亞基及Dx5亞基的標記(圖3)。說明Bx7OE亞基及Dx5亞基同時導入‘濟麥22’的比例較高。

2.4 籽粒性狀及優質亞基聯合篩選

在育種實踐中，農民及面粉企業更傾向于種植及收購籽粒為“白色”的小麥種子及原糧，即“白粒”小麥品種。因此，F3代材料中以籽粒顏色進行了后代篩選，重點專注于“白粒”后代，結合Bx7OE亞基及Dx5亞基分子標記檢測結果，發現僅9個受檢材料籽粒為“白粒”，在9個白粒材料中，V21、V27、V29中既含有Bx7OE亞基又含有Dx5亞基，V24僅含有Bx7OE亞基，V22、V25、V28、V30中僅含有Dx5亞基，V23中不含Bx7OE亞基和Dx5亞基(圖4)。

2.5 小麥籽粒顏色及Bx7OE亞基和Dx5亞基編碼基因的遺傳特性

通過對F1代籽粒顏色調查發現，F1代均表現為紅色籽粒。說明‘津強1號’的籽粒顏色紅色為顯性性狀，‘濟麥22’的白色籽粒為隱性性狀，因此，在F3代中，紅色籽粒顯著高于白色籽粒。

通過對Bx7OE亞基、Dx5亞基編碼基因的序列比對分析，編碼這兩個基因的座位位于小麥第1同源群的B、D染色體上(圖5)，與已知的小麥控制籽粒顏色的基因不在同一個同源群上，獨立分離。

3 討論與結論

編碼高分子量谷蛋白的基因位于小麥基因組的第一同源群的A、B、D染色體長臂上，由復等位基因控制，兩個基因在同一條染色體上連鎖遺傳[23]。在普通小麥的基因組上，編碼HMW-GS的基因分別位于Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點，每個位點編碼兩個HMW-GS的亞基，按照分子量大小分為x、y亞基。其中x亞基分子量較大，y亞基分子量較小[24]。由于小麥中存在基因沉默現象，在大部分栽培小麥中Glu-A1y通常處于沉默狀態[25]，Glu-B1y有時也不能表達。在普通栽培小麥種中只有4個或者5個HMW-GS亞基表達。且Dx5與Dy10連鎖，Dx5與Dy10共同存在，因此僅檢測Dx5就可以代表這個基因座位的導入情況。但是由于Bx7OE位于小麥B組染色體上，而Dx5+Dy10位于小麥D組染色體上(圖5)，因此Bx7OE和Dx5+Dy10不連鎖，存在分離現象(圖4)。

59個F3代材料的分子標記研究結果顯示，在33個F3代材料中檢測到了Bx7OE亞基(圖1)，占檢測群體的55.93%，在41個樣本中檢測到Dx5亞基(圖2)，占總檢測樣本的69.49%，上述樣品中有27份材料既存在Bx7OE亞基也存在Dx5亞基，占總測試樣品的45.76%(圖3)。結合59個與‘濟麥22’農藝性狀接近的受檢材料，說明Bx7OE和Dx5+Dy10導入‘濟麥22’的比例較高，但是STS分子標記為基因序列檢測，只要序列存在即可檢出，不能區分純合子與雜合子，因此雖然導入比例加較高，但是并不能確定材料中Bx7OE和Dx5+Dy10亞基所在座位是否純合。這27個材料可能存在大量的雜合子，需要后續進行分子標記跟蹤及蛋白SDS-PAGE檢測Bx7OE和 Dx5+Dy10的表達情況。

研究表明小麥籽粒紅色為顯性性狀，白色為隱性性狀[26]，在經過F2代農藝性狀篩選的59個F3代株系中，僅9個純系白色籽粒性狀，說明‘津強1號’籽粒紅色性狀對‘濟麥22’籽粒白色性狀也顯性，與其他品種的研究結果吻合。同時，研究表明部分品種籽粒紅色性狀受一對等位基因控制，F2呈現紅白粒3∶1分離[26]，部分品種籽粒紅色性狀受二對等位基因控制，F2代呈現15∶1[26]，二者均呈現籽粒紅色顯著多于籽粒白色性狀，F3代中白色籽粒將顯著低于紅色籽粒，因此F3代受檢的59份樣本中，白色籽粒顯著少于紅色籽粒，但是白色籽粒為純合性狀，后代不會出現分離現象。因此可以重點保留籽粒白色、含有Bx7OE+8、5+10亞基的材料。

農藝性狀初步觀察及染色體遺傳特性分析發現，雖然‘津強1號/濟麥22’后代篩選了農藝性狀傾向于‘濟麥22’的材料，但由于1/2的‘津強1號’染色體的滲入，導致后代不能完全保留‘濟麥22’的優異性狀， Bx7OE+8、5+10亞基所在基因座位位于兩個同源群，因此應在F3代中篩選農藝性狀偏向于‘濟麥22’的材料與‘濟麥22’進行回交，確保Bx7OE+8、5+10亞基導入后保持‘濟麥22’的其他優異性狀。