LysR型轉錄因子 STM0859對鼠傷寒沙門菌環境耐受性的調控作用

馬忠梅，寧程程，李 娜，季春暉， 孟慶玲，喬 軍，張星星，才學鵬

(1. 石河子大學 動物科技學院，新疆石河子 832003； 2. 新疆農墾科學院 畜牧獸醫研究所， 新疆石河子 832000；3. 中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，蘭州 730046)

鼠傷寒沙門菌(Salmonellaentericasubspecies enterica serovartyphimurium，ST)是一種重要的人獸共患革蘭氏陰性致病菌。人和動物感染該菌后，可引起胃腸炎、敗血癥以及流產等臨床癥狀[1]。ST在世界范圍內流行，廣泛存在于自然界中[2]，嚴重危害畜禽養殖業的健康發展[3]。同時，作為一種重要的食源性病原菌，該菌可通過動物性食品感染人類，引起食物中毒，給全球食品安全和公共衛生造成嚴重威脅[4]。ST可以在低溫、高滲、酸性等應激環境下生存，并在一定條件下形成生物被膜來抵抗體內外的不利環境，增強其生存能力[5]。

研究發現，為適應復雜多變的環境，ST需要眾多的轉錄因子來調節特定基因的轉錄與表達。LysR蛋白家族是在原核生物中發現的一個重要轉錄因子家族，與細菌群體感應、毒力、生物活性控制、生物被膜形成和細胞分裂等的調控相關[6]。生物信息學分析顯示，ST- STM0859蛋白為新型LysR家族轉錄因子。然而，至今國內外尚未開展ST- STM0859對ST基因轉錄調控作用的研究。因此，開展ST-STM0859生物學功能研究對于揭示ST基因表達調控的機制具有重要科學 價值。

λ-Red同源重組技術是近年發展起來的一種基因敲除技術，已廣泛應用于細菌的基因敲除[7]。為了探究LysR家族轉錄因子 STM0859對ST環境應激的調控作用，本研究利用λ-Red同源重組技術敲除ST-STM0859基因，并檢測分析STM0859基因缺失株對不同脅迫環境的適應能力，探究 STM0859對ST環境應激的調控作用，為揭示 STM0859調控ST基因表達的分子機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

ST-SL1344強毒株、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、質粒pKD46、pKD3和pCP20由石河子大學預防獸醫學實驗室保存；TaqDNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T載體、T4DNA Ligase和DNA Marker均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒和質粒小量提取試劑盒均購自天根公司；LB肉湯培養基和SS瓊脂培養基購自北京奧博星生物技術有限公司；氨芐青霉素、氯霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、蛋白胨和酵母浸出物均購自英國Oxoid生物有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司。

1.2 引物設計

根據GenBank登錄的STM0859基因序列(登錄號：FQ312003.1)，通過Primer 5.0軟件設計以pKD3質粒為模板，5′端含有50 bp的STM0859同源左右臂，3′端與pKD3質粒上氯霉素抗性基因同源互補的引物R1和R2；檢測pKD46的特異性引物R3和R4；pCP20驗證引物R5和R6；缺失株構建后驗證及測序引物R7和R8；引物均由北京華大基因生物公司合成(表 1)。

表1 構建 STM0859基因缺失株的特異性引物Table 1 Specific primers for construction of STM0859 gene deletion strain of ST

1.3 打靶基因的擴增

以pKD3為模板，R1/R2為引物，擴增用于敲除STM0859基因的打靶片段。PCR反應體系如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，67 ℃退火50 s，72 ℃延伸80 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，并與pMD19-T(simple)載體連接，轉化至DH5α感受態細胞，PCR篩選陽性克隆，測序驗證。

1.4 ST-SL1344感受態細胞的制備及pKD46質粒的電轉化

挑取ST-SL1344單菌落接種于20 mL LB液體培養基，置于37 ℃，180 r/min過夜培養。以1∶100轉接入LB培養基，使OD600達到 0.4～0.6，制備感受態細胞。提取pKD46質粒，電轉化至ST-SL1344感受態細胞，挑取陽性轉化子PCR鑒定，作為同源重組的宿主菌。

1.5 打靶片段的電轉化

制備SL1344-pKD46感受態細胞，將打靶片段轉化至SL1344-pKD46感受態細胞。電轉完成后迅速加入42 ℃預熱的1 mL SOC培養基，輕輕吹打混勻后置于37 ℃，180 r/min振蕩培養2 h，取200 μL菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板(Amp質量濃度為100 ng/mL，Cm質量濃度為34 ng/mL)，37 ℃恒溫培養，PCR鑒定并篩選陽性轉化子。

1.6 ST- △STM0859缺失株的構建與鑒定

制備消除pKD46質粒的重組菌ST-△STM0859cat感受態細胞，電轉化pCP20質粒，將轉化后的菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，置于30 ℃恒溫培養箱過夜培養。PCR鑒定陽性克隆，得到ST-△ STM0859缺失株并進行測序驗證。

1.7 ST- △STM0859缺失株對環境應激適應能力的測定

挑取ST-SL1344和ST-△STM0859單菌落分別接種于BHI液體培養基中，37 ℃過夜培養，調整菌液濃度使初始菌的OD600≈0.055，于 37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養，每隔1 h取200 μL菌液測OD600值，連續測定12 h，觀察其生長速度。以1∶100的比例分別接種于50 mL pH為4、10和含有4%NaCl(%為質量體積比)、0.1%H2O(體積分數)和3%乙醇(體積分數)的BHI液體培養基中，置于37 ℃，180 r/min振蕩培養；每間隔1 h測其OD600值，繪制生長曲線，觀察 STM0859基因缺失對ST在不同脅迫環境條件下生長特性的影響。

1.8 STM0859缺失對ST運動能力的影響

挑取ST-SL1344和ST-△ STM0859單菌落分別接種于BHI液體培養基中，37 ℃過夜培養，將OD600值調至1.0，吸取1 μL菌液點樣于LB及pH為4、5和6的0.3%半固體培養基(質量體積比)，置于37 ℃靜止培養16 h。通過測量在平板中遷移形成圓圈直徑的大小分析不同pH對其運動能力的影響。

2 結果與分析

2.1 打靶基因的擴增與pKD46質粒的電轉化

以pKD3為模板，R1/R2為引物擴增大小為1 198 bp的打靶片段，擴增產物含有STM0859基因上下游同源臂和Cm抗性基因，條帶大小與預期一致(圖 1-a)。用特異性引物R3/R4對陽性轉化子進行PCR驗證，片段大小為1 127 bp，與預期值大小一致(圖 1-b)，測序結果證實pKD46質粒電轉成功。

2.2 缺失株ST- △ STM0859 的鑒定

將pCP20質粒電轉至1344△ STM0859cat感受態細胞，用R5/R6引物進行PCR驗證(圖2-a)。用檢測引物R7/R8對野生株ST-SL1344和ST-△ STM0859cat攜帶pCP20質粒的陽性轉化子進行PCR驗證，野生株擴增出1 146 bp的片段，ST-△ STM0859cat擴增出220 bp 片段(圖 2-b)。測序結果也進一步證實成功構建ST-△ STM0859基因缺失株。

2.3 ST- △ STM0859 對不同應激環境的適應能力

生長曲線如圖 3所示，以第12小時為時間點做差異分析，與親本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株生長能力與親本株基本一致；在4%NaCl、0.1%H2O2、3%乙醇及pH=10的脅迫環境中二者生長速度差異不顯著；但在pH=4的酸性應激中適應能力顯著下降，差異極顯著(P<0.01)。表明STM0859參與ST對酸應激環境耐受的調控過程。

2.4 ST- △ STM0859 在不同pH半固體中的運動能力

運動能力檢測結果顯示，與親本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株在LB及pH為6的半固體中運動能力差異不顯著；但在pH為4時，ST-△ STM0859缺失株運動能力降低(圖 4)，與親本株相比差異極顯著(P<0.01)(圖 5)；提示 STM0859參與對ST在酸性環境下運動能力的調控。

3 討 論

ST在自然界生存過程中，已經進化出多種對抗不利環境的應激策略[8]，并利用多種轉錄調控因子在轉錄水平上調節其生存必需基因(如毒素，黏附素和菌毛)的表達，以達到適應不同應激環境的目的[9]。ST作為一種重要的消化道致病菌，可在胃中低pH環境中生存，并侵入腸上皮細胞引起機體感染。ST被內化后，對細胞中吞噬溶酶體中的低pH內環境產生抵抗作用，并在巨噬細胞中生存和繁殖[10]。因此，感知和響應pH變化對于ST的生存至關重要。有研究報道，ST可在不同生長環境中活化多個低pH誘導的存活系統，在對數期和固定期發生的誘導型耐受反應可以產生不同的酸性休克蛋白，以防止和修復大分子在極端酸性條件下受損[11]。此外，有研究發現，在ST上還存在另一種pH形成穩態的耐酸調控機制，即氨基酸脫羧酶系統，能在一定條件下抵抗直接的酸脅迫。

LysR型轉錄調節子是寡聚細菌轉錄因子的不同家族，遺傳進化分析顯示該因子在ST菌株間核苷酸序列上具有同源性和保守性的DNA結合域，可與靶基因的啟動子區域結合，調控靶基因的表達[12]。LysR型轉錄調節因子是目前發現的重要轉錄因子調節家族，廣泛存在于大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌，根瘤菌和陰溝腸桿菌等中。已有的研究顯示，LysR家族在細菌不同的生長環境中表達差異顯著，參與調控細菌的代謝、群體感應、毒力、運動性、氧化應激反應、毒素產生等[13]。研究肺炎克雷伯菌LysR轉錄因子oxyRKP時發現，oxyRKP參與調控該菌的氧化應激反應、最低抑菌濃度及毒力等[14]。鼠傷寒沙門菌LysR轉錄因子OxyR、SpvR、LeuO、CysB參與了氧化應激、細菌嚴謹反應、半胱氨酸生物合成、毒力因子合成等[15]。Chen等[16]發現惡臭假單胞菌LysR轉錄因子pnpR正調節自身的表達和pnpC1C2DECX1X2操縱子的表達；然而其在碳源利用中發揮負調節作用。Fu等[17]發現，在嗜水鏈球菌中，LysR轉錄因子參與了其耐藥性的調節。提示LysR型轉錄因子對細菌不同基因的表達發揮不同的調控作用。STM0859蛋白屬于ST -LysR家族轉錄因子，其蛋白二級結構含有1個DNA底物結合域和1個由螺旋-轉角-螺旋構成的HTH-18結構域。序列比較發現，其N端含有1個H-T-H超二級結構域，C端具有1個PBP2配體結合域，與大腸桿菌和不動桿菌LysR家族轉錄調控因子相似。

本研究在前期研究的基礎上，利用λ-Red同源重組技術成功構建ST-△ STM0859缺失株，檢測分析ST-△ STM0859在不同脅迫環境下的生長情況。與親本株相比，在pH為4的酸性環境下，ST-△ STM0859的生長及運動能力明顯降低(P<0.01)，表明ST- STM0859參與ST對酸應激的適應性調控，為深入揭示ST-STM0859介導酸調控的分子機制奠定研究基礎。