甘加型藏羊發(fā)情周期血漿雌激素測定及HPO軸ERα的表達

包瑩瑩，陳衛(wèi)剛，何玉琴，楊志杰，葛聞博，張 霞，周凱仁，楊大鵬

( 甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術(shù)學院，蘭州 730070)

甘加型藏羊是甘南草地型藏羊中的優(yōu)良地方類型之一，生活在2 800 m以上的高海拔地區(qū)，典型的季節(jié)性(7—9月)發(fā)情動物，發(fā)情周期平均為(16 ± 2)d，每年產(chǎn)羔1 次，1 次1 胎，繁殖率較低[1]。下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸對雌性哺乳動物的生殖活動發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。雌激素主要由卵巢分泌，目前發(fā)現(xiàn)主要有雌酮(Estrone,E1)、雌二醇(17β-estradiol,E2)和雌三醇(Estriol，E3)，其中E2的含量最高且生理活性最強[2]。雌激素分泌后進入血液與性激素結(jié)合球蛋白、清蛋白可逆性結(jié)合，游離的雌激素也可隨血液循環(huán)進入靶器官，與雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結(jié)合后通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，調(diào)節(jié)機體各個系統(tǒng)(如心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等)[2-3]的生理功能。ER是核受體蛋白超家族中的一種轉(zhuǎn)錄因子，它包括兩種經(jīng)典亞型ERα和ERβ[4]。研究表明，ERα是維持雌性動物HPO軸負反饋穩(wěn)態(tài)的主要受體形式[5]。在哺乳動物中，雌激素協(xié)同卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)促進卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)排卵前黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)激增，從而觸發(fā)排卵[6]。因此，雌激素及其受體的生理研究一直被國內(nèi)外學者廣泛關(guān)注。已有研究報道豬[7]、山羊[8]、牛[9]等動物發(fā)情周期內(nèi)血漿雌激素的變化規(guī)律，ERα也被證明在大鼠[10]、雙峰駝[11]、山羊[12]等哺乳動物生殖軸中均有表達。但有關(guān)甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)血漿雌激素變化規(guī)律及其受體表達分布的研究鮮見報道[13]。因此，本研究以甘加型藏羊為試驗對象，運用ELISA檢測其發(fā)情周期內(nèi)血漿雌激素含量變化，運用RT-qPCR、Western blot及免疫組織化學染色法檢測HPO組織中ERαmRNA及其蛋白的表達差異，探討雌激素及其受體α對甘加型藏羊發(fā)情周期的影響，并為進一步研究生殖相關(guān)激素對藏羊繁殖的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗于藏羊繁殖季節(jié)(7—9月)在甘肅省甘南州夏河縣甘加鄉(xiāng)某藏羊養(yǎng)殖場進行，選取32只年齡2.5～3.5歲的雌性健康且未孕的甘加型藏羊，根據(jù)公羊爬跨試情(公羊爬跨時記為0 h)，按照四期分法[14]，即發(fā)情前期(第14天早上～第16天晚上)、發(fā)情期(第0～36 小時)、發(fā)情后期(第39～72 h)及間情期(第4天早上～第13天晚上)分為4組，每組8只羊。發(fā)情期每2 h采血1次，發(fā)情后期每3 h采血1次，間情期和發(fā)情前期每天早(7：00)晚(19:00)各采血1次。每次肝素鈉抗凝真空采血管頸靜脈采血10 mL，3 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到干凈的血漿管中， -20 ℃冰箱保存，備用。檢測判定下一個發(fā)情周期，分別在發(fā)情周期內(nèi) 4 個時期的中間宰殺取樣，即在發(fā)情期第12小時、發(fā)情后期第66 小時、間情期第9天和發(fā)情前期第15天處死試驗羊后迅速采取下丘腦、垂體及卵巢組織，將組織等體積分為兩半，一半放到體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液中，一半迅速放入液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃ 冰柜保存，備用。

1.2 血漿雌激素的測定

按ELISA試劑盒(奇松生物，北京)說明測定血漿中雌激素的OD值。根據(jù)標準品的OD值及相應(yīng)濃度繪制標準曲線，得到回歸方程y= 0.026 9x-0.105 5，其中y代表OD值，x代表雌激素含量。

1.3 HPO組織ERα mRNA檢測

根據(jù)RNA提取試劑盒(TransGen，北京)說明書分別提取甘加型藏羊不同發(fā)情周期下丘腦、垂體和卵巢組織中總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen，北京)說明書，以20 μL體系進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈-20 ℃ 保存，備用。

根據(jù)NCBI中已有的綿羊ERα和β-actinmRNA序列設(shè)計引物(Primer Premier 5.0)，引物由上海生工生物公司合成(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，按TranScriptTip Green qPCR SupperMix(TransGen，北京)20 μL總體系進行RT-qPCR。反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性30 s； 94 ℃變性 5 s， 60 ℃退火30 s，進行45次循環(huán)；72 ℃延伸10 s。每個樣品做3次重復(fù)。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer of RT-qPCR

1.4 HPO組織ERα蛋白檢測

分別將下丘腦、垂體及卵巢組織在低溫條件下充分研磨后，各稱取100 mg研磨液，加入蛋白裂解液(1 mL裂解液+10 μL蛋白酶抑制劑)(Bioss,北京)，冰上充分裂解后4 ℃ 、12 000 r/min離心5 min，取上清液，按體積比3∶1與 4×上樣緩沖液混合，98 ℃水浴變性后-20 ℃保存，備用。

配制5%的濃縮膠和12%的分離膠，每孔加8 μL蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后對照Marker預(yù)染條帶切取ERα(66 ku)、β-actin(42 ku)對應(yīng)膠條，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Solarbio，北京)上；PBST(PBS + tween 20)(Bioss,北京)溶液洗膜后用50 g/L脫脂奶粉(Bioss,北京)封閉20 min；加ERα(Bioss,北京)一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜4 h；加二抗(1∶3 000稀釋)37 ℃水浴孵育1 h，PBST洗膜2 h；暗室曝光。

1.5 HPO組織ERα免疫組織化學染色

石蠟切片(厚4 μm)常規(guī)脫蠟處理后微波法抗原修復(fù)10 min，操作按過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(Bioss，北京)說明進行。用體積分數(shù)3% H2O2濕盒孵育15 min，正常山羊血清工作液37 ℃封閉15 min，ERα抗體稀釋液 (1∶800)4 ℃孵育過夜后，37 ℃溫箱孵育2 h，再用生物素標記的二抗37 ℃孵育15 min，然后用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素親和工作液37 ℃孵育15 min。每次孵育后用PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)洗滌3次，每次5 min。DAB(Bioss,北京)顯色10 min，蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余條件和步驟均相同。染色切片均用Olympus-71型光學顯微鏡(日本)觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各時期血漿雌激素含量根據(jù)回歸方程計算得出；RT-qPCR結(jié)果用2-ΔΔCt法計算發(fā)情周期不同階段各組織中基因的相對表達量，每個基因表達量均以β-actin內(nèi)參基因進行校正；Western blot所得蛋白條帶灰度值用Image J 軟件分析，以ERα與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示ER蛋白的相對量；所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0進行方差性分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿雌激素含量變化規(guī)律

甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)血漿雌激素含量檢測結(jié)果表明，整個發(fā)情周期內(nèi)E2呈現(xiàn)動態(tài)變化。由圖1可知，發(fā)情期和發(fā)情后期血漿雌激素呈波動式和脈沖式分泌，且發(fā)情期分泌量最高，發(fā)情第10 h時達到第1個峰值(97.21±1.78) ng/mL，之后分別在第24 、32、36、42、48、57、66、72小時出現(xiàn)峰值；由圖2可知，間情期和發(fā)情前期血漿雌激素主要呈波動式分泌，在第6天早上、12天早上、13天晚上和16天早上出現(xiàn)峰值，維持在 47.86～71.82 ng/mL。發(fā)情期血漿雌激素平均含量顯著高于發(fā)情前期和間情期(P<0.05)(表2)。

表2 發(fā)情周期各時期平均雌激素含量Table 2 E2 content of Ganjia Tibetan sheep in diestrus and proestrus

2.2 HPO組織中ERα mRNA表達分析

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，甘加型藏羊發(fā)情周期不同時期下丘腦、垂體和卵巢組織中均有ERαmRNA表達，且表達差異顯著(圖 3)。下丘腦(圖3-A)中ERαmRNA在發(fā)情后期相對表達量最高，間情期最低，發(fā)情前期與發(fā)情期差異不顯著(P>0.05)；垂體(圖3 -B)中發(fā)情期ERαmRNA相對表達量最高，顯著高于其他 3 個時期(P< 0.05)，間情期最低，發(fā)情前期與發(fā)情后期表達差異不顯著(P>0.05)；卵巢(圖3-C)中ERαmRNA相對表達量發(fā)情前期最高，間情期最低，各時期差異顯著(P<0.05)。

2.3 HPO組織ERα蛋白的表達分析

Western blot檢測結(jié)果顯示，甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)下丘腦、垂體和卵巢組織中均有ERα蛋白表達(圖4)。下丘腦ERα蛋白表達量(圖4-A)從發(fā)情前期開始呈上升趨勢，發(fā)情后期達到最高，間情期又降低，發(fā)情前期最低，發(fā)情期與間情期差異不顯著(P>0.05)，其他時期均差異顯著(P<0.05)；垂體中(圖4-B)發(fā)情期最高，顯著高于間情期(P<0.05) ，發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期差異不顯著(P>0.05)；卵巢(圖4-C)中發(fā)情前期表達量最高，發(fā)情期最低，顯著低于其他 3 個時期(P<0.05)。

2.4 HPO組織ERα定位分析

甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)下丘腦、垂體、卵巢組織的免疫組化結(jié)果(圖 5)顯示，ERα陽性產(chǎn)物為黃色或棕黃色，所有陰性對照組試驗樣本均為陰性，證明試驗選用的ERα一抗具有特異性。

在下丘腦促垂體區(qū)大神經(jīng)元胞體和神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞核均有ERα分布(圖5-A～圖5-D)；在垂體遠側(cè)部和中間部嗜酸性細胞胞核中ERα高表達，胞漿中表達微弱(圖5-F～圖5-I)；卵巢中ERα分布于生長卵泡顆粒細胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細胞及黃體細胞胞漿中(圖5-K～圖5-N)。

3 討 論

本研究運用酶聯(lián)免疫分析法對甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)血漿雌激素進行檢測，發(fā)現(xiàn)甘加型藏羊血漿雌激素呈波動式和脈沖式交替分泌，這與葛仕豪等[8]的研究結(jié)果一致。提示雌激素參與動物發(fā)情周期的調(diào)控。甘加型藏羊發(fā)情周期血漿雌激素含量發(fā)情前期逐漸增加，發(fā)情期最高，在發(fā)情第10小時達到第1個峰值，說明藏羊在發(fā)情第10小時形成排卵前峰，為排卵做準備。之后分別在第24、32、36、42、48、57、66、72小時及第6天早上、12天早上、13天晚上和16天早上出現(xiàn)峰值。海門山羊[15]、波爾山羊[16]及黑白花奶牛[17]等哺乳動物E2在發(fā)情當天最高，之后開始下降，到發(fā)情前2～3 d開始上升，這與本研究結(jié)果相似，可見雌激素在哺乳動物發(fā)情周期中具有相同的分泌規(guī)律。余四九等[14]指出，綿羊在發(fā)情周期第8天左右出現(xiàn)的E2峰值越顯著排卵率越高，而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘加型藏羊第6天早上的峰值不顯著，預(yù)示排卵率不高，這可能是甘加型藏羊低繁殖率的原因之一。雌激素是由卵巢分泌的一種甾體類激素，是雌性哺乳動物體內(nèi)重要的激素之一。雌激素隨著血液循環(huán)擴散與靶器官上特定受體ER結(jié)合發(fā)揮作用，也可直接作用于靶器官[3]。發(fā)情周期中，雌激素可通過正、負反饋作用調(diào)節(jié)卵巢、下丘腦和垂體等的生理功能[18]。筆者發(fā)現(xiàn)，ERαmRNA及其蛋白在甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)下丘腦中的表達差異顯著，且發(fā)情后期最高，提示ERα參與藏羊發(fā)情周期的調(diào)控。最近研究表明，雌激素的反饋作用是借Kisspeptin/GPR54信號系統(tǒng)實現(xiàn)的[19]。雌性綿羊下丘腦弓狀核中Kisspeptin神經(jīng)元介導(dǎo)了雌激素對促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin-releasing hormone,GnRH)和LH釋放的負反饋作用[20]。有研究報道，GnRH神經(jīng)細胞不表達ERα，而大部分Kiss1細胞表達ERα[21]。結(jié)合本研究結(jié)果，ERα在甘加型藏羊下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞核和大神經(jīng)元胞漿高表達，且在發(fā)情周期各階段變化差異顯著，與陳衛(wèi)剛等[22]的研究結(jié)果相似，推測ERα通過Kisspeptin/GPR54信號系統(tǒng)參與調(diào)控甘加型藏羊發(fā)情周期等繁殖活動。

性腺分泌的雌激素以內(nèi)分泌方式，下丘腦等腦部組織及垂體自身合成的雌激素以旁分泌或自分泌方式作用于腺垂體，使腺垂體FSH和LH的分泌受到影響，進而影響卵巢性激素的合成與分泌，參與調(diào)控動物的生殖生理活動[23]。研究表明綿羊下丘腦的弓狀核區(qū)E2通過非經(jīng)典信號途徑抑制Kisspeptin的表達，從而負反饋調(diào)控GnRH的釋放[24]。在靈長類動物[25-26]、綿羊[27]和嚙齒動物[28-29]中，只有當足夠高的E2信號或增加的E2持續(xù)幾個小時時才會引起LH/GnRH激增，進而誘導(dǎo)ER、GnRHR等的表達。對照本試驗結(jié)果，發(fā)情前期開始，ERαmRNA及其蛋白在垂體中表達量逐漸升高，發(fā)情期表達量最高，之后開始下降，到間情期達最低，提示在甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)ERα的表達可能受到循環(huán)的E2的調(diào)節(jié)。在發(fā)情期和發(fā)情后期，當E2水平較高時，ERα表達量也升高，提示E2上調(diào)ERα的表達。免疫組織化學試驗結(jié)果顯示，ERα陽性反應(yīng)發(fā)情后期垂體遠側(cè)部和中間部細胞核分布最多，這與張慶紅等[30]的研究結(jié)果一致。

卵巢作為主要的雌性生殖器官，兼有外分泌(產(chǎn)生并排出卵子)和內(nèi)分泌(分泌雌激素和孕酮)的雙重功能，在雌性生殖中占主導(dǎo)作用[31-32]。敲除ERα的成年小鼠出現(xiàn)囊腫性或血性卵泡，表現(xiàn)出不孕[33]。孟金柱等[34]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋小黃卵泡液中雌激素含量顯著高于其他卵泡液，說明雌激素直接影響卵泡的發(fā)育和選擇。葛均邦等[35]提出雌激素通過其核受體調(diào)控C型鈉肽(Natriuretic peptide C,NPPC)/鈉肽受體2(Natriuretic peptide receptor 2，NPR2)mRNA水平，參與卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)，Chao等[36]也提出雌激素還可通過其核受體影響DNA甲基化水平進而影響卵母細胞的成熟與發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)ERαmRNA及蛋白的相對表達量在發(fā)情前期最高，各時期表達差異顯著；ERα陽性表達在生長卵泡顆粒細胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細胞及黃體細胞胞漿中分布，這與孫建紅等[37]研究的ERα免疫反應(yīng)產(chǎn)物在山羊卵巢中的分布結(jié)果一致。發(fā)情期，優(yōu)勢卵泡發(fā)育完全，顆粒細胞開始大量分泌雌激素[18]。推測高濃度的雌激素與ERα結(jié)合，促進卵泡的發(fā)育及卵母細胞的成熟，其具體作用機理還需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示甘加型藏羊發(fā)情周期內(nèi)血漿中雌激素呈動態(tài)變化，表明E2參與甘加型藏羊發(fā)情周期的調(diào)控。ERαmRNA及其蛋白在整個發(fā)情周期HPO組織中均有表達及分布，且表達呈現(xiàn)出差異性，提示下丘腦、垂體和卵巢組織是雌激素參與調(diào)控藏羊生殖活動的重要靶點，對藏羊發(fā)情周期具有重要的調(diào)控作用。