過氧化氫誘導心肌細胞凋亡的實驗研究

曾蘭芬，張新敏，肖 雪，孫國亮，李浩波，張良清

（1 廣東醫科大學附屬醫院麻醉科 廣東 湛江 524000）

（2 吉林大學第一醫院麻醉科 吉林 長春 130000）

（3 中山大學附屬第三醫院麻醉科 廣東 廣州 510000）

心肌缺血及再灌注后心肌細胞自身或浸潤的炎性細胞釋放大量活性氧（ROS），致大量心肌細胞死亡[1-2]。本文以H9C2 心肌細胞為研究對象，旨在探索H2O2誘導心肌細胞凋亡的濃度及處理時間。

1.資料與方法

1.1 實驗材料

H9C2 心肌細胞株購自上海中國科學院細胞庫；H2O2溶液購自ATT Bioquest 公司；CCK-8、活性氧及細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司；所用抗體購自CST 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自thermo fisher 公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；高糖DMEM 基礎培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco 公司；PBS、雙抗（青/鏈霉素）購自北京索萊寶科技有限公司。倒置顯微鏡購自德國徠卡公司；離心機購自德國艾本德公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；酶標測試儀購自德國Berthoid 公司；全自動化學發光圖像分析系統購自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及培養

從-80℃冰箱取出凍存的細胞，放于37℃水浴鍋內使其迅速融化，加入等量完全培養基，離心，棄上清，用完全培養基重懸細胞，按合適密度鋪板，置于37℃的5% CO2培養箱中培養，當細胞匯合度達90%及以上時，予傳代處理。

1.2.2 氧化應激模型建立

將H9C2 細胞接種于96 孔板，待貼壁后，進行后續處理。按H2O2濃度梯度將實驗分為6 組：對照組、50μm H2O2組、100μm H2O2組、200μm H2O2組、300μm H2O2組及400μm H2O2組，各組加入不同H2O2濃度處理6 h，檢測細胞活力及LDH 水平，確定合適的H2O2濃度。按H2O2處理時間梯度將實驗分為6 組，對照組、2 h 組、4 h 組、6 h 組、12 h 組及24 h 組，加入相同濃度H2O2，于不同時間點檢測細胞活力及LDH水平，確定H2O2合適的處理時間。

1.2.3 細胞活力檢測

將H9C2 心肌細胞接種于96 孔板，細胞貼壁后，予相應處理后，加CCK8 試劑10μl，37℃孵育2 h，酶標儀檢測各組細胞相關的吸光度。

1.2.4 細胞上清LDH、MDA 及SOD 水平檢測

收集各組細胞上清，按照試劑盒說明書進行實驗操作，酶標儀檢測各組細胞上清OD 值，按公式計算出對應數值。

1.2.5 細胞活性氧（ROS）水平檢測

按照活性氧檢測試劑盒說明書進行操作，孵育完成后，用無血清培養基洗滌細胞3 次，熒光顯微鏡下計數單視野下陽性細胞。

1.2.6 蛋白表達水平檢測

按分組處理細胞，收集細胞沉淀，RAPI 裂解液冰上裂解細胞30 min，4℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法定量，SDS-PAGE 膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，孵一抗，4 ℃過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，孵二抗，室溫1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL 法曝光檢測。

1.2.7 細胞凋亡流式細胞術檢測

收集細胞到1.5 mL 離心管中，加入100 μl Binding Buffer，吹打重懸細胞，避光加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，混勻后室溫（避光）孵育30 min，上機檢測。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計軟件分析相關數據。計量資料采用均數±標準差（± s）表示，行t 檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 氧化應激模型建立

H2O2濃度梯度實驗：與對照組比，50μm H2O2組及100μm H2O2組細胞活力及LDH 水平差異無統計學意義（P均＞0.05）；200μm H2O2組、300μm H2O2組及400μm H2O2組細胞活力降低、LDH 水平升高，差異有統計學意義（P 均＜0.05）。選取濃度為200μm H2O2進行后續實驗。H2O2處理時間梯度實驗：與對照組比，2 h 組及4 h 組細胞活力及LDH 水平差異無統計學意義（P 均＞0.05）；6 h 組、12 h 組及24 h 組細胞活力降低、LDH 水平升高，差異有統計學意義（P 均＜0.05）。其中12 h 組心肌細胞活力約為63%，適合進行后續實驗，所以選擇200μm H2O2處理細胞12 h作為建立H9C2心肌細胞氧化應激模型的條件。見表1。

表1 各組細胞活力及LDH 水平檢測（OD 值）

2.2 兩組氧化應激水平比較

H2O2組心肌細胞ROS 陽性細胞比例、MDA 水平均高于對照組，SOD 水平明顯下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 兩組ROS、MDA 及SOD 水平比較（OD 值）

2.3 細胞凋亡情況比較

H2O2組Bax、Cleaved/caspase-3 以及凋亡率均高于對照組，Bcl-2 低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組細胞凋亡相關指標檢測

3.討論

氧化應激損傷致心肌細胞凋亡在心肌缺血及再灌注中起重要作用，誘導氧化應激致心肌細胞凋亡模型的成功建立可為心肌梗死的臨床治療及藥物開發提供實驗基礎，具重大意義。而H2O2在各種活性氧（ROS）生產者中起核心作用[3]，用H2O2誘導心肌細胞氧化應激損傷是正確選擇。但目前用H2O2誘導心肌細胞凋亡的處理條件相差甚大[4-5]。本研究旨在探究H2O2誘導H9C2 心肌細胞凋亡合適的濃度及處理時間，結論是200μm H2O2處理H9C2 心肌細胞12h可明顯導致心肌細胞凋亡。實驗過程發現H2O2性質很不穩定，建議分裝長期存于-20℃，短期避光存于4℃。另外，H2O2品牌、細胞狀態以及操作因素等也會影響H2O2用量及處理時間。建議購買濃度精確的H2O2，保證實驗細胞處于良好生長狀態，以及保證實驗操作的一致性。

綜上所述，本研究成功探索出H2O2誘導H9C2 心肌細胞凋亡的方法，并發現其中存在的問題及提出建議。將對后期H2O2誘導心肌細胞凋亡模型構建具有重要的指導意義。