過氧化氫建立的高氧環境對幽門螺桿菌清除作用的研究*

狄 佳 張 軍 屈 偉 程 妍 常丹燕 鄭向紅&

西安交通大學第二附屬醫院核醫學科1(710004) 消化內科2

背景：隨著幽門螺桿菌(Hp)對抗菌藥物耐藥性和感染復發率的上升，高效清除Hp的難度日益增大。目的：探討過氧化氫(H2O2)建立的高氧環境對Hp的清除作用及其可能機制。方法：使用溶解氧測定儀測定體內外條件下的H2O2溶液氧含量。以H2O2處理Hp標準菌株和野生型菌株；建立蒙古沙鼠Hp感染模型并予H2O2干預。紫外分光光度計檢測Hp生長情況；常量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)；Giemsa染色觀察胃黏膜Hp定植情況；透射電子顯微鏡和正苯基萘胺法觀察Hp細胞膜形態學及其滲透性變化。結果：水溶液和家兔胃液中添加H2O2后，溶液氧含量顯著升高(P均<0.05)。Hp在含H2O2液體培養基中的生長水平隨H2O2濃度升高而逐漸降低，直至完全不生長。蒙古沙鼠經H2O2溶液灌胃14 d，胃黏膜定植的Hp數量接近于零。H2O2可誘導Hp細胞膜損傷、破裂，胞質溢出，細胞膜滲透性顯著增高(P<0.05)。結論：H2O2能有效提高水溶液中的氧含量，在體內外條件下均能對Hp發揮高效清除作用，其機制與菌體細胞膜損傷密切相關。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種革蘭陰性微需氧彎曲棒狀桿菌，已被證實是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤的主要致病因子，并與胃癌發生密切相關[1-2]。目前全世界大部分國家和地區的人群存在不同程度的Hp感染，總體感染率超過50%(約44億)[3]。抗菌藥物的應用是根除Hp感染的主要手段，但近年來隨著Hp對抗菌藥物耐藥性的顯著增加，根除成功率急劇下降，感染復發率迅速上升[4-5]。因此，尋求能高效清除Hp的新方法對于提高Hp感染的臨床治療水平以及預防胃癌等Hp相關疾病的發生具有重要意義。

作為一種專性微需氧菌，Hp對生長條件要求苛刻，其生長環境最適宜的氧含量約為5%～6%[6]。氧含量過高如大氣環境，或過低如厭氧環境，均易導致Hp死亡。由此，本課題組根據Hp的微需氧特性提出了一種通過建立高氧環境以清除Hp的全新思路：利用過氧化氫(H2O2)分解釋放氧氣來提高環境中的氧含量，以實現對Hp賴以生存的微需氧環境的有效破壞，從而促進Hp死亡，最終達到高效除菌的目的。本研究旨在探討H2O2是否能有效提高溶液中的氧含量，驗證H2O2在體內外條件下對Hp的清除作用，并進一步探索除菌過程中Hp死亡的可能機制。

材料與方法

一、Hp菌株、實驗動物、主要試劑和儀器

Hp國際標準菌株ATCC43504(美國模式菌種收集中心)；Hp野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分離自就診于西安交通大學第二附屬醫院內鏡中心、診斷為消化性潰瘍且13C-尿素呼氣試驗結果陽性患者的胃黏膜組織(倫理審批號：2016-1033)。

家兔由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2014-003；蒙古沙鼠由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

30% H2O2(廣州金華大化學試劑有限公司)；Hp專用液體培養基(青島海博生物技術有限公司)；哥倫比亞綿羊血瓊脂培養基(Thermo Fisher Scientific)；枸椽酸鉍鉀片/替硝唑片/克拉霉素片三聯藥物(麗珠維三聯?，麗珠集團麗珠制藥廠)；Giemsa染液(上海遠慕生物科技有限公司)；阿莫西林膠囊(金石寧?，國藥集團汕頭金石制藥有限公司)；正苯基萘胺(大連美侖生物技術有限公司)；Triton X-100(合肥博美生物科技有限責任公司)。

溶解氧測定儀(WTW, Xylem Analytics Germany Sales GmbH & Co. KG.)；紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；普通光學顯微鏡(Olympus)；透射電子顯微鏡(Hitachi)；熒光酶標儀(Molecular Devices, LLC.)。

二、方法

1. 體外水溶液和家兔胃液氧含量測定

①體外水溶液氧含量測定：將30%H2O2與蒸餾水混合，分別配制成0.02、0.09、0.40、2.00 mg/mL H2O2溶液，以蒸餾水作為空白對照，溶解氧測定儀測定各組H2O2溶液氧含量。

②家兔胃液氧含量測定：將8只家兔隨機分為2組，每組4只。禁食24 h，麻醉后沿胃幽門處作一切口，插入溶解氧測定儀探針，使用縫合線將探針扎緊于胃幽門切口，另將十二指腸端扎緊。測定給藥前(0～10 min)胃液氧含量后，兩組分別吸取 0.5、1.0 mg/mL H2O230 mL注入胃內，再次測定胃液氧含量。

2. Hp培養及其生長情況檢測：以Hp國際標準菌株ATCC43504為例，吸取1×108CFU/mL Hp菌液200 μL，以體積比1∶100分別加入含0.8、1.0、1.2 mg/mL H2O2的Hp專用液體培養基，同時設立空白對照組，置于37 ℃恒溫震蕩培養箱內，150 r/min微需氧環境下培養5 d，紫外分光光度計每日檢測液體培養基A600 nm。實驗重復3次。

3. 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concen-tration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)測定：MIC系指經體外培養18～24 h后抑制細菌生長的最低藥物濃度，是測定抗菌藥物活性的重要指標[7]，MBC則是指殺死99.9%的細菌所需的最低藥物濃度[8]。本研究采用常量肉湯稀釋法測定MIC和MBC[9]。在1×108CFU/mL的Hp菌液中以體積比1∶100分別加入含倍數濃度H2O2的Hp專用液體培養基，37 ℃震蕩培養24 h，觀察液體培養基渾濁度。選取培養基清澈透明無細菌生長的最低H2O2濃度作為MIC。吸取上述清澈透明液體培養基100 μL，分別接種于哥倫比亞綿羊血瓊脂平板，微需氧條件下培養3 d，選取無菌落生長的最低H2O2濃度作為MBC。實驗重復5次。

4. 蒙古沙鼠Hp感染模型建立和干預：將60只蒙古沙鼠隨機分為6組，每組10只：空白對照組、Hp組、1、2、4 mg/mL H2O2組和三聯藥物組。后 5組禁食4 h后予1×108CFU/mL ATCC43504菌液15 mL/kg灌胃，每日1次，連續20 d。Hp感染模型成功建立后，三組H2O2組分別予1、2、4 mg/mL H2O2水溶液15 mL/kg灌胃，三聯藥物組予三聯藥物混懸液(枸櫞酸鉍鉀25 mg/L，替硝唑2 mg/L，克拉霉素1 mg/L) 15 mL/kg灌胃，Hp組予蒸餾水15 mL/kg灌胃，均為每日1次，連續14 d。

5. 蒙古沙鼠胃黏膜Hp計數：蒙古沙鼠麻醉后處死，剪取大小約2 cm2的腺胃部分胃黏膜，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，Giemsa染色觀察胃黏膜完整性和Hp分布。于光學顯微鏡高倍視野(×1 000)下隨機選取5個視野計數Hp，每視野以1個點表示。每只實驗動物制作1張切片，每組共計50個點。

6. Hp細胞膜形態學觀察：使用透射電子顯微鏡觀察 H2O2(2 mg/mL)處理前后 ATCC43504菌株細胞膜超微結構變化，以阿莫西林(0.04 mg/mL)處理作為陽性對照，蒸餾水處理作為空白對照。各組Hp給藥后孵育20 min，離心獲取1 mm3菌體沉淀，2.5%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定，PBS沖洗后濃度梯度丙酮脫水(30%、50%、70%、80%、90%、100%)，無水丙酮/環氧樹脂以5∶1、3∶1、1∶3、1∶5比例包埋，切片后檸檬酸鉛-乙酸鈾雙染色，干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察。

7. 正苯基萘胺法測定Hp細胞膜滲透性：制備1×108CFU/mL ATCC43504菌液，隨機分為空白對照組、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL H2O2組和Triton X-100組(陽性對照)，并予相應處理。吸取300 μL菌液，加入6 μL正苯基萘胺溶液(500 μmol/L)，混勻后加入黑色避光96孔板，每孔100 μL；在激發波長315 nm和發射波長400 nm條件下，以熒光酶標儀測定每孔相對熒光強度。實驗重復3次。

三、統計學分析

結 果

一、H2O2對水溶液和家兔胃液氧含量的影響

空白對照組水溶液在37 ℃正常大氣條件下的氧含量為(6.72±0.56) μg/mL，與El-Sherif等[10]的報道(6.7～6.8 μg/mL)相一致。與空白對照組相比，0.02、0.09、0.40、2.00 mg/mL H2O2組水溶液氧含量明顯升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)，各組平均氧含量分別為空白對照組的1.17、1.36、2.22和3.97倍(圖1A)。

給藥前(0～10 min)家兔正常胃液氧含量為(3.65±0.48)μg/mL；注入H2O2溶液后(10～30 min)，0.5、1.0 mg/mL H2O2組胃液氧含量明顯升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)，兩組平均氧含量分別為正常胃液的4.17和5.15倍(圖1B)。

二、體外培養條件下H2O2對Hp的清除作用

Hp國際標準菌株ATCC43504的生長曲線呈對數形態。培養5 d后，0.8、1.0 mg/mL H2O2組A600 nm與空白對照組相比差異均無統計學意義(P均> 0.05)，1.2 mg/mL H2O2組A600 nm則較空白對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05；圖2A)。3株Hp野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ培養5 d后A600 nm變化趨勢與ATCC43504相似(圖2B-2D)。

與空白對照組(A)或0～10 min正常胃液(B)比較，*P<0.05，**P<0.01

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

H2O2對ATCC43504和野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的MIC分別為(1.75±0.35)、(0.65±0.15)、(1.10±0.50)、(0.95±0.45) mg/mL，MBC分別為(2.10±0.70)、(1.55±0.85)、(2.05±1.15)、(2.30±0.90) mg/mL。

三、H2O2對動物體內Hp的清除作用

各組蒙古沙鼠胃黏膜組織Giemsa染色顯示，Hp組細菌數量較空白對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，表明Hp感染模型建立成功。1、2、4 mg/mL H2O2組與空白對照組相比，Hp數量未見明顯增加(P均>0.05)，表明H2O2能有效清除Hp；三聯藥物組Hp數量則較空白對照組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，表明清除效果不理想(圖3)。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

四、H2O2對Hp細胞膜的作用

透射電子顯微鏡觀察顯示，空白對照組Hp菌體細胞膜完整且透明，胞質均勻分布；H2O2組菌體細胞膜損傷、破裂、模糊不清，胞質溢出；阿莫西林組作為陽性對照，僅菌體細胞壁出現變形損傷，細胞膜完整(圖4)。

阿莫西林僅破壞Hp細胞壁，細胞膜完整(黑色箭頭示菌體細胞膜；比例尺：300 nm)

正苯基萘胺法細胞膜滲透性檢測顯示，0.5、1.0、2.0 mg/mL H2O2組相對熒光強度依次增高，且均明顯高于空白對照組，除0.25 mg/mL組外，差異均有統計學意義(P均<0.05)；Triton X-100組作為陽性對照，相對熒光強度明顯高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05；圖5)。上述發現表明，Hp細胞膜滲透性隨H2O2濃度增加而逐漸增高。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

Hp作為一種典型的微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于人和動物的胃竇黏膜上皮表面和黏液底層。目前，質子泵抑制劑聯合抗菌藥物仍是根除Hp感染的主要方法，根除治療方案主要包括標準三聯療法、鉍劑/非鉍劑四聯療法(伴同療法、序貫療法等)[11]。然而，由于Hp耐藥性等問題的存在，實現高效清除Hp的目標仍然十分困難。本研究利用Hp的微需氧特性，擬通過H2O2分解釋放氧氣的方式提高環境中的氧含量，最終誘導Hp死亡。

正常大氣條件下，37 ℃水溶液的氧含量約為6.8 μg/mL[12]；而在微需氧條件下，本課題組預實驗結果顯示，37 ℃水溶液的氧含量約為1.7～2.0 μg/mL。由于Hp定植于胃黏膜表面并被胃液包圍浸潤，可推斷胃液屬于適宜Hp生長的微需氧環境，即胃液氧含量也應在1.7～2.0 μg/mL范圍內。當環境中的氧含量超過5.0 μg/mL(15%V/V)時[6]，Hp因生存適應能力達到極限而無法存活。本研究證實，在37 ℃正常大氣條件下，隨著H2O2濃度的增加(0.02～2.00 mg/mL)，水溶液中的氧含量隨之升高，達到7.86～26.67 μg/mL，遠遠超過Hp極限生存的氧含量5.0 μg/mL。同樣，家兔胃內注入H2O2溶液(0.5和1.0 mg/mL)后，胃液氧含量也顯著升高，達到15.23和18.78 μg/mL，這一氧含量足以殺滅Hp。因此，H2O2在體內外條件下釋放的氧含量均滿足高效清除Hp的要求。

Hp在含H2O2的液體培養基中震蕩培養5 d后，其生長狀態發生顯著變化，生長曲線呈現類似于“全”或“無”的趨勢。低濃度H2O2組的Hp生長曲線呈對數形態，近似于空白對照組，表明在該氧含量下Hp尚能正常生長；而高濃度H2O2組Hp生長趨勢差，曲線平緩，表明細菌無法生長甚至已死亡；中等濃度H2O2組的Hp生長曲線則多呈現先抑制、后生長的趨勢，表明其生長狀態介于抑制與正常之間。本研究結果顯示H2O2對Hp國際標準菌株ATCC43504和野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的MIC上限為2.1 mg/mL，MBC上限為3.2 mg/mL，說明這些Hp菌株均對H2O2敏感，能被H2O2有效抑制和清除。本研究在體外條件下證實，H2O2建立的高氧環境對Hp這類微需氧菌具有廣譜高效的清除作用。

蒙古沙鼠是目前國際公認的適用于Hp感染研究的動物模型[13]，具有感染率高、定植菌量大、感染后組織學改變與人類相似等諸多優點。本研究通過Giemsa染色證實，蒙古沙鼠感染Hp后胃黏膜中有大量細菌定植，表明模型建立成功。經H2O2溶液連續灌胃14 d，各濃度H2O2組蒙古沙鼠胃黏膜Hp數量與空白對照組相比均無明顯增加，表明H2O2在體內環境中同樣發揮了高效清除Hp的作用，與體外實驗結果一致。而三聯藥物組給藥14 d后胃黏膜中仍存在大量Hp，提示較之臨床常用于根除Hp的鉍劑與抗菌藥物組合，H2O2療效更為顯著。

H2O2為強氧化劑，如期望今后應用于Hp感染的臨床治療，將其濃度控制在安全范圍內以充分保證使用安全性十分必要。根據本研究體內外除菌實驗結果，2 mg/mL是H2O2在蒙古沙鼠中清除Hp的適宜濃度。本課題組在預實驗階段分別通過急性毒性實驗和胃黏膜損傷實驗驗證了H2O2在體內應用的安全性。在急性毒性實驗中，接受2 mg/mL H2O2灌胃14 d的蒙古沙鼠和昆明小鼠全部存活，體質量未見明顯減輕；胃黏膜損傷實驗證實經10 mg/mL H2O2灌胃的昆明小鼠胃黏膜完整、未見損傷，而阿司匹林陽性對照組小鼠胃黏膜可見多發糜爛灶，表明濃度不超過10 mg/mL的H2O2經口給藥不會損傷胃黏膜。上述證據表明2 mg/mL H2O2經口給藥不會出現毒性反應，且不會造成胃黏膜損傷，安全性良好。

本研究還探討了H2O2清除Hp的機制是否與菌體細胞膜損傷有關。透射電子顯微鏡觀察直接證實了2 mg/mL H2O2處理后的Hp細胞膜破壞嚴重，而阿莫西林陽性對照組僅有菌體細胞壁變形損傷，細胞膜保持完整。進一步利用正苯基萘胺與細胞膜磷脂結合產生藍色熒光的特點觀察Hp細胞膜滲透性的變化[14]，結果顯示相對熒光強度隨H2O2濃度增加呈現劑量依賴性上升趨勢，表明菌體細胞膜滲透性逐漸增高，間接證實了細胞膜破裂程度逐漸加重。

利用H2O2分解釋放氧氣的特點建立高氧環境，在體內外條件下均可成功清除Hp。目前這一成果已申請國家發明專利(CN109223825A)，設想未來可將適宜濃度的H2O2制成多種劑型，如口服液、片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑等，從而實現科研成果的臨床轉化。然而，目前距H2O2成功應用于臨床Hp根除治療還有相當大的距離，其藥理學、毒理學、藥代動力學等研究均有待進一步深入。首先，除口服外，還需探究其他給藥途徑的可行性，如腹腔局部給藥、靜脈給藥等，并選擇最佳給藥方式；其次，應明確H2O2發揮除菌作用的劑量效應和時間效應；最后，需闡明H2O2清除Hp的關鍵機制，驗證其發揮作用的具體分子靶點和相關信號通路。在進入臨床試驗前，需綜合評價上述研究數據對擬行的臨床試驗的支持程度，以確保安全。

綜上所述，本研究證實H2O2能有效提高水溶液中的氧含量，在體內外條件下均能對Hp發揮高效清除作用，其機制與菌體細胞膜損傷密切相關。根據Hp的微需氧特性，通過提高環境氧含量誘導Hp死亡，最終達到高效除菌目的，這一方法從從全新角度解決Hp感染的清除問題，為臨床根除Hp提供了新思路和新選擇。