Ang(1-7)通過調節Treg/Th17平衡參與保護NSAIDs相關小腸損傷

潘宜久 王連魁 熊 華,2#

寧波市杭州灣醫院消化內科1(315336)上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科 上海市消化疾病研究所2

背景：非甾體抗炎藥(NSAIDs)廣泛應用于臨床。隨著內鏡技術的進步，NSAIDs相關小腸損傷越來越多見，但目前尚無明確有效的防治措施。目的：探討調節性T細胞(Treg細胞)與Th17細胞失衡在NSAIDs相關小腸損傷中的作用以及血管緊張素1-7 [Ang(1-7)]的保護效應。方法：30只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組、模型組和Ang(1-7)治療組，后兩組使用雙氯芬酸鈉誘導小腸損傷模型。5 d后處死大鼠，取小腸黏膜觀察大體和組織學損傷情況；以ELISA法和(或)免疫組化法檢測Ang(1-7)以及促炎和抗炎細胞因子水平；流式細胞術分析Treg、Th17細胞占CD4+ T細胞的比例。結果：模型組大鼠小腸黏膜廣泛充血、水腫，散在多發糜爛、小潰瘍。Ang(1-7)治療組小腸損傷明顯減輕，黏膜輕度充血、水腫，散在少量小糜爛灶。治療組小腸組織Ang(1-7)、抗炎細胞因子水平、Treg細胞數量和Treg/Th17比值較模型組顯著升高，抗炎細胞因子水平和Th17細胞數量較模型組顯著降低(P均<0.05)。Pearson相關系數分析顯示，小腸黏膜Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關(r=0.847, P<0.05)。結論：Treg/Th17失衡可能是NSAIDs相關小腸損傷的重要發病機制，而Ang(1-7) 可能通過調節Treg/Th17平衡參與保護NSAIDs相關小腸損傷。

非甾體抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)具有抗炎、解熱、鎮痛等作用，廣泛應用于臨床。隨著該類藥物臨床應用的增多，其消化道不良反應越來越受到人們的關注。NSAIDs相關胃腸道損傷可導致潰瘍、出血、穿孔等并發癥發生[1]。與胃十二指腸損傷不同，NSAIDs引起的小腸損傷癥狀多為非特異性甚至無癥狀[2]，因小腸損傷住院治療的患者多以出血、穿孔、梗阻等嚴重并發癥為首發表現。目前對NSAIDs相關小腸損傷尚無明確有效的防治措施，因此，迫切需要進一步明確損傷發生機制，從而為其臨床防治尋找新的策略。

血管緊張素1-7 [angiotensin 1-7, Ang(1-7)]是腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system)的新組分，可發揮舒張血管、降低血壓、增加局部血流量以及抗炎等作用。有研究[3]表明Ang(1-7)可顯著減輕小鼠結腸炎模型的結腸炎癥損傷，然而，關于Ang(1-7)對NSAIDs相關小腸損傷是否具有保護作用，目前尚無明確結論。調節性T細胞(Treg細胞)與Th17細胞是一對免疫平衡細胞，正常情況下兩者處于動態平衡狀態。近年來，多項研究發現Treg/Th17失衡在炎癥和自身免疫性疾病的發生、發展中發揮重要作用[4-5]，例如在三硝基苯磺酸(TNBS)實驗性結腸炎模型小鼠腸道中存在以Treg/Th17失衡為主導的炎癥反應。本研究通過構建雙氯芬酸鈉誘導的NSAIDs相關小腸損傷大鼠模型，探討Treg/Th17失衡在NSAIDs相關小腸損傷中的作用以及Ang(1-7)的保護效應，以期為NSAIDs相關小腸損傷的防治提供潛在靶點。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

1. 實驗動物：雄性Sprague-Dawley大鼠30只，8周齡，體質量(200±20) g，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心(合格證號：2008001664294)，使用該中心提供的標準飼料喂養。動物飼養于獨立通氣籠盒中，每籠5只，清潔級環境(溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，適宜光照條件)，自由進食、飲水，專人管理。

2. 主要試劑：雙氯芬酸鈉(Sigma-Aldrich?, Merck KGaA)；Ang(1-7)(Tocris Bioscience)；Ang(1-7)、白細胞介素-6(IL-6)、IL-17A、IL-10、轉化生長因子-β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)；Ang(1-7)兔抗鼠多克隆抗體(Cloud-Clone Corp.)；大鼠CD4 FITC、CD25 APC、CD4 APC、IL-17A PE單克隆抗體，小鼠/大鼠Foxp3 PE單克隆抗體，大鼠IgG2a κ PE同型對照，小鼠IgG2a κ APC同型對照(eBioscienceTM, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 動物分組和模型制備：采用隨機數字表法將30只大鼠分為3組：對照組、模型組和Ang(1-7)治療組，每組10只。參考Cooper等[6]的方法使用雙氯芬酸鈉制備小腸損傷模型。將100 mg雙氯芬酸鈉溶于100 mL 0.9% NaCl溶液中，配制l mg/mL溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量予大鼠連續灌胃5 d。Ang(1-7)治療組藥物劑量參考Tesanovic等[7]的研究，將 9.6 mg Ang(1-7)溶于1 mL滅菌水中，配制成9.6 μg/μL溶液，分別注入10只100 μL膠囊微泵中，于雙氯芬酸鈉灌胃造模前1 d將膠囊植入大鼠頸背部皮下，以24 μg·kg-1·h-1的速度持續皮下微泵給藥至造模結束。對照組予10 mL·kg-1·d-10.9% NaCl溶液灌胃，不作其他處理。5 d后處死各組大鼠，觀察腹腔內有無出血、腹水，以及腹水性質和腸道組織粘連情況。

2. 組織病理學檢查：分離大鼠小腸組織，肉眼觀察大體損傷情況。參考Murano等[8]采用的大體形態損傷評分標準(表1)，評估腸黏膜潰瘍和炎癥程度。于距回盲部5 cm處向口側切取兩段2 cm長的小腸組織備用(肉眼觀有糜爛、潰瘍等病變的取病變及其周邊組織)，其中一份4%甲醛溶液固定，另一份置入凍存管后液氮保存，隨后轉入-80 ℃冰箱凍存待測。

表1 腸黏膜大體形態損傷評分標準

小腸組織標本4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、3～4 μm厚連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察，拍照。參考Chiu氏評分標準[9]進行小腸組織學損傷評分(表2)，每只動物5張切片，每張切片隨機觀察4個高倍視野(×200)，結果取均值。

表2 腸黏膜組織學損傷Chiu氏評分標準

3. ELISA法檢測小腸組織Ang(1-7)和炎癥細胞因子水平：參照相應ELISA試劑盒說明書進行操作，以酶標儀測定小腸組織Ang(1-7)、IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β1水平。

4. 免疫組化法檢測小腸組織Ang(1-7)表達：石蠟包埋小腸組織3～4 μm厚連續切片，行SP法免疫組化染色，操作步驟參照試劑說明書進行。每只動物5張切片，每張切片于光學顯微鏡高倍視野(×200)下選取3～5個視野，每視野計數200個以上細胞中的陽性染色細胞數，計算陽性標記指數(陽性標記指數=視野內陽性細胞數/視野內細胞總數×100%)，結果取均值。

5. 流式細胞術檢測小腸黏膜Treg、Th17細胞比例：大鼠解剖后迅速取小腸黏膜，0.9% NaCl溶液清洗2～3次，立即置于預冷RPMI1640培養基中，剪碎、研磨、擠壓、過濾后得到單細胞懸液，預冷PBS洗滌后離心，調節細胞濃度為2×106/mL，參照試劑說明書進行操作，上流式細胞儀(BD FACSCantoⅡ)檢測Treg、Th17細胞占CD4+T細胞的比例。

三、統計學分析

結 果

一、腹腔和小腸組織大體觀察

對照組大鼠小腸黏膜光滑，無充血、水腫，無糜爛、潰瘍。模型組大鼠造模第3天死亡1只，解剖后見大量血性腹水和腸穿孔；其余大鼠小腸黏膜廣泛充血、水腫，散在多發糜爛、小潰瘍，偶見小穿孔，伴腸系膜淋巴結腫大，損傷多在系膜側。Ang(1-7)治療組大鼠小腸損傷明顯減輕，黏膜輕度充血、水腫，散在少量小糜爛灶，未見明顯潰瘍和穿孔。模型組大體損傷評分較對照組明顯升高，Ang(1-7)治療組評分則較模型組明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05；圖1、表3)。

圖1 各組大鼠小腸大體損傷

二、小腸組織病理學改變

對照組大鼠小腸黏膜結構未見明顯缺損和異常，絨毛排列整齊。模型組大鼠小腸黏膜缺損，部分絨毛倒伏、缺失，上皮壞死嚴重，可見潰瘍，固有層水腫明顯，伴大量炎癥細胞浸潤。Ang(1-7)治療組大鼠小腸絨毛輕度水腫、增粗，偶見上皮層小缺損，固有層內少量炎癥細胞浸潤。模型組組織學損傷評分較對照組明顯升高，Ang(1-7)治療組評分則較模型組明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05；圖2、表3)。

圖2 各組大鼠小腸組織病理學改變(HE染色，×100)

表3 各組大鼠小腸組織大體和組織學損傷評分比較

三、小腸組織Ang(1-7)表達水平變化

ELISA法和免疫組化法檢測顯示，模型組大鼠小腸組織Ang(1-7)含量和陽性標記指數均較對照組明顯降低，Ang(1-7)治療組相應數據則較模型組明顯升高，差異均有統計學意義(P均<0.05；表4、圖3、圖4)，表明外源性Ang(1-7)干預可升高小腸組織中的Ang(1-7)表達水平。

表4 各組大鼠小腸組織Ang(1-7)表達水平比較

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

圖4 各組大鼠小腸組織Ang(1-7)表達免疫組化染色圖

四、小腸組織炎癥細胞因子水平

ELISA法檢測顯示，模型組大鼠小腸組織IL-6、IL-17A水平較對照組明顯升高，IL-10、TGF-β1水平較對照組明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；Ang(1-7)治療組IL-6、IL-17A水平較模型組明顯降低，IL-10、TGF-β1水平較模型組明顯升高，差異均有統計學意義(P均<0.05；表5、圖5)。

表5 各組大鼠小腸組織炎癥細胞因子水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

五、小腸黏膜Treg/Th17比值

流式細胞分析顯示，模型組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細胞占CD4+T細胞的比例均較對照組明顯增加，但Treg/Th17比值較對照組明顯降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)；Ang(1-7)治療組Treg細胞比例較模型組明顯升高，Th17細胞比例較模型組明顯降低，Treg/Th17比值較模型組明顯升高，差異均有統計學意義(P均<0.05；表6、圖6)。

表6 各組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細胞比例和Treg/Th17比值比較

圖6 各組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細胞比例(流式細胞分析)

六、小腸組織Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值的相關性

Pearson相關系數分析顯示，小腸黏膜組織中的Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關(r=0.847,P<0.05)。

討 論

NSAIDs在臨床實踐中廣泛應用于急慢性炎癥，如風濕性關節炎、骨關節炎等疾病的治療。其中阿司匹林因其穩定的抗血小板凝集作用，已成為心腦血管疾病的一級預防用藥。此外，其對結直腸癌也有一定的預防作用[10]。然而，隨著該類藥物適應證的擴大，其不良反應尤其是胃腸道不良反應的發生率逐漸增加。早年由于檢查手段的限制，對NSAIDs相關胃腸道不良反應的研究主要集中于胃十二指腸損傷，近年來，由于質子泵抑制劑(PPIs)、黏膜保護劑等的使用，胃十二指腸黏膜損傷的發生率明顯下降，但此類藥物對包括小腸在內的下消化道損傷并無明確防治作用，甚至有研究表明，長期預防性使用PPIs可能通過影響腸道菌群增加小腸隱匿性出血和潰瘍發生率[11]。近年來，隨著內鏡技術的進步，如膠囊內鏡的應用，NSAIDs相關小腸損傷越來越多見，在長期服用NSAIDs的患者中，約50%存在小腸黏膜損傷[2]。而且，大部分NSAIDs相關腸病患者無臨床癥狀，需住院治療者多以出血、穿孔、梗阻等嚴重并發癥為首發表現。NSAIDs相關腸病的發病機制復雜，迄今尚未完全明確，既往多聚焦于三級打擊學說、環氧合酶(COX)雙重抑制學說、NSAIDs的肝腸循環以及腸道菌群變化等方面[12]，目前臨床上缺乏有效的防治措施。因此，進一步明確NSAIDs相關小腸損傷的發病機制是迫切需要解決的問題。

Th17細胞和Treg細胞均由初始CD4+T細胞增殖分化而來，前者主要通過分泌IL-17A、IL-21等細胞因子參與機體自身免疫和炎癥反應，后者則通過分泌IL-10、TGF-β1等細胞因子抑制免疫炎癥反應，維持機體的免疫耐受。正常情況下兩者處于一種動態平衡狀態，對維持機體免疫穩態起重要作用。維甲酸受體相關孤核受體γt(RORγt)和叉頭蛋白3(Foxp3)分別是參與調控Th17和Treg細胞分化的特異性轉錄因子[13]，Foxp3缺乏可導致Treg細胞分化減少，從而引發過度免疫反應，造成組織損傷。除促進Th17細胞分化、產生大量IL-17A外，RORγt還可抑制T細胞產生IL-10，從而維持Th17細胞的致病性[14]。Treg/Th17平衡在不同疾病模型和病情階段存在不同的變化趨勢。綜合相關研究結果，在炎癥初發和進展階段，機體和局部免疫水平上調，Treg和Th17細胞數量均有不同程度的增加，整體上以Th17細胞增加為主，通過分泌IL-17A等促炎細胞因子促進炎癥發生、發展；至炎癥后期和修復階段，Th17細胞比例明顯降低，Treg細胞比例逐漸升高，通過分泌IL-10等抗炎細胞因子抑制炎癥持續，促進機體和局部組織修復。近年已有一系列關于Treg/Th17平衡在炎癥性腸病等疾病中作用的研究發表[4-5,15]，但其與NSAIDs相關小腸損傷之間的關系尚無確切結論。本研究發現，在雙氯芬酸鈉誘導的大鼠小腸損傷模型中，Th17細胞占CD4+T細胞的比例顯著上升，盡管Treg細胞比例也較對照組升高，但Treg/Th17比值較對照組明顯下降，表明NSAIDs相關小腸損傷時存在Treg/Th17失衡。模型組大鼠小腸組織IL-6、IL-17A表達升高，IL-10、TGF-β1表達降低，表明在NSAIDs相關小腸損傷中，Treg/Th17失衡致促炎/抗炎細胞因子失衡，進而促進炎癥進展，造成組織損傷。

Ang(1-7)是腎素-血管緊張素系統的新組分，具有明顯的抗炎效應，可減輕結腸炎、哮喘等疾病動物模型的炎癥程度[3,16-17]。Ang(1-7)在體內主要由AngⅡ水解產生，與其特異性受體MAS結合后發揮抗炎、舒張血管、降低血壓等與AngⅡ相反的生物學功能，因而被認為是AngⅡ的內源性拮抗劑[18-19]。本研究予模型大鼠外源性Ang(1-7)干預，探究Ang(1-7)在NSAIDs相關小腸損傷中的作用及其可能機制。實驗結果顯示，經Ang(1-7)干預的模型大鼠小腸組織Ang(1-7)表達水平明顯升高，大體和組織學損傷較模型組明顯減輕，Th17細胞占CD4+T細胞的比例以及IL-6、IL-17A水平亦較模型組明顯降低，同時Treg細胞比例、Treg/Th17比值以及IL-10、TGF-β1水平較模型組明顯升高，且小腸組織中的Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關，表明Ang(1-7)對NSAIDs相關小腸損傷具有保護作用，此種保護作用可能與調節Treg/Th17平衡有關，相關信號通路和分子機制尚待進一步研究。

綜上所述，本研究發現NSAIDs相關小腸損傷時存在Treg/Th17失衡，這可能是NSAIDs相關小腸損傷的重要發病機制；Ang(1-7)對NSAIDs相關小腸損傷具有保護作用，其機制可能與調節Treg/Th17平衡有關，Treg/Th17平衡可能是防治NSAIDs相關小腸損傷的潛在靶點。后續研究擬通過干預Treg/Th17相關細胞因子，為NSAIDs相關腸病的臨床治療提供新的思路。