抗HBV新藥展望

張曉東，趙麗娜

1 南開大學生命科學學院 腫瘤研究室，天津 300071；2 天津醫科大學腫瘤醫院 腫瘤研究所，天津 300060

HBV感染是世界范圍內的重要公共衛生問題。全球有約2.57億人感染HBV。感染HBV后發展為慢性乙型肝炎(CHB)的原因有：HBV為部分環狀DNA病毒，血液中的HBV比較容易清除，但是組織細胞中的HBV很難清除，而且易發生免疫耐受、基因整合和基因變異。CHB有發展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌(HCC)的風險[1]。然而，CHB很少能徹底治愈[2-3]。有力的證據表明，當前抗病毒治療缺乏療效是由于它們無法消除游離型HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)，而它們是病毒基因組和病毒復制的轉錄模板的持久形式[4-5]。較為理想的抗HBV藥物應該具有良好的安全性，作用較持久且停藥無反跳，激發宿主免疫應答，強效抑制病毒復制甚至清除病毒[6]。抗HBV藥物可分為兩類：一是直接干擾病毒復制的某一環節的抗HBV藥物；二是通過阻斷宿主因子與病毒相互作用以抑制病毒復制的藥物。

1 抗HBV藥物

目前治療CHB的方法(已上市應用于臨床的藥物)包括聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)和口服核苷(酸)類似物。目前在研的抗HBV藥物主要分為三大類：直接抗病毒藥物、免疫類藥物和其他抗HBV藥物。

1.1 直接抗病毒藥物

完整的HBV生命周期包括附著、進入、脫衣殼、轉運到細胞核、cccDNA形成、轉錄、翻譯、包衣、組裝和分泌。直接作用抗病毒的方式是針對病毒并干擾HBV復制過程(圖1)，目前主要包括7類：病毒進入抑制劑、RNA干擾劑、反義核酸藥物、逆轉錄酶抑制劑、核衣殼蛋白抑制劑、HBsAg抑制劑和基因編輯藥物等。

圖1 抗HBV新藥作用機制示意圖

1.1.1 病毒進入抑制劑 病毒進入抑制劑一種是以細胞成分為靶點干擾HBV與細胞受體結合，另一種以病毒顆粒為靶點阻止HBV附著于肝細胞[7-8]。牛磺膽酸鈉協同轉運多肽(NTCP)主要表達于肝細胞的基底外側膜[9]。有研究[10]證明，NTCP是HBV和HDV的一種功能受體，它能幫助病毒進入肝細胞，HBV表面蛋白(HBs)中的前S1 區(pre-S1)被用來附著在NTCP受體上[10]。Myrcludex B是一種來源于HBsAg的HBV大蛋白(LHBs)pre-S1的合成脂多糖，作為一種入胞抑制劑抑制HBV進入細胞[11]，其可降低HBV DNA水平，安全性及耐受性均較好[12]。目前Myrcludex B在已經披露的 Ⅱ a期臨床試驗中。此外，上海賀普藥業的賀普拉肽(Hepalatide)通過與HBV肝細胞感染受體NTCP結合，阻斷HBV感染。

1.1.2 RNA干擾劑 RNA干擾劑由siRNA組成，具有較高的特異性，通過干擾HBV的mRNA來減少所有HBV的轉錄，由于HBV是一個具有區域重疊的緊湊基因組，單個siRNA可以抑制核心蛋白、表面蛋白、聚合酶和X蛋白的產生。通過直接阻斷HBV復制，間接促進HBV免疫，降低HBsAg和HBeAg的表達[13]。siRNA ARC-520是美國Arrowhead公司推出的臨床首次開發的siRNA。ARC-520對HBs轉錄沒有影響，因為ARC-520的目標序列在核心啟動子位點上游，靠近整合HBs序列的插入位點。為了解決這個問題，Arrowhead公司制造了一種針對該區域的第二代siRNA，它涵蓋了整合型和cccDNA來源的HBs的轉錄本。這有效地降低了HBeAg陽性和HBsAg陰性的CHB患者的HBsAg水平[14-16]。目前，許多開發者，如Arrowhead和Alnylam，都有活躍的siRNA開發項目。

1.1.3 反義核酸藥物 反義藥物主要指反義寡核苷酸，其核苷酸序列可與靶mRNA或靶DNA互補，抑制或封閉該基因的轉錄和表達，干擾致病蛋白的產生過程，即干擾遺傳信息從核酸向蛋白質的傳遞。Ionis與GSK合作開發的反義藥物IONIS-HBVRx(GSK 3228836)目前正處于臨床 Ⅱ 期，前期臨床數據顯示IONIS-HBVRx對HBsAg和HBV DNA具有明顯的抑制活性。此外，Aligos Therapeutics公司的ALG-020572正處于臨床前研究階段。

1.1.4 逆轉錄酶抑制劑 逆轉錄酶抑制劑是指核苷(酸)類似物，其抗HBV的機理是干擾HBV的核苷酸代謝，直接作用于病毒逆轉錄酶，阻斷HBV復制。這些藥物已成為這些年來抗病毒藥物的研究熱點，優點是安全、有效、易行。但核苷(酸)類藥物沒有抗HBsAg而產生全身性的免疫抑制的作用，因此，一旦不再治療，病毒會再次復活，需要終身治療，而且易引起原發性耐藥或繼發性耐藥，一旦停藥，容易反彈[17-19]，因為其抑制HBV復制，對cccDNA庫沒有影響。

1.1.5 核衣殼蛋白抑制劑 衣殼蛋白是用來保護HBV DNA的蛋白外殼，靶向衣殼組裝和拆卸是很有前途的抗病毒策略[20]。衣殼抑制劑通過破壞核心粒子的組裝從而抑制核殼蛋白合成和病毒DNA復制；或導致衣殼分解的化合物(通過中斷衣殼的拆卸)都會阻礙rcDNA進入細胞核，從而阻礙rcDNA轉化為cccDNA[20]。因此，核衣殼蛋白抑制劑是很有前途的抗病毒策略。

由小分子組成的抑制劑附著在核心蛋白上，引起變構調節，阻止二聚和核衣殼組裝[21]。這些分子包括雜芳基二氫嘧啶、苯丙烯酰胺、吡啶酮衍生物和磺胺酰苯甲酰胺。甲磺酸莫非賽定和齊魯制藥的QL-007目前正處于臨床 Ⅱ 期，甲磺酸莫非賽定在28天的短期治療中，不但可以顯著降低HBV DNA，而且可以有效地降低HBeAg水平。

1.1.6 HBsAg抑制劑 核酸聚合物(NAPs)通過硫代反義寡核苷酸(PS-ONs)抑制病毒復制過程中的蛋白相互作用，對包膜病毒有廣泛的抑制活性。HBsAg抑制劑可以抑制感染HBV的肝細胞釋放HBsAg，繼而破壞HBsAg誘導的免疫機制而發揮抗病毒作用。在此領域走在前列的是加拿大的Replicor公司，分別為REP-2139(已經進入臨床Ⅲ期)和REP-2165(已經進入臨床Ⅱ期)。

1.1.7 基因編輯藥物 滅活或消除cccDNA是降低HBV重新激活風險的唯一方法[22]。體外CRISPR/Cas9實驗可以使HBV cccDNA基因編碼的cccDNA和HBV蛋白水平均下降[23]。然而，為了確保對宿主DNA的最小脫靶毒性，CRISPR/Cas9必須缺乏與人類遺傳物質的交叉反應性，并且必須具有將基因編輯工具專門傳遞至肝細胞核的能力。而且目前缺乏針對cccDNA的標準化測量(cccDNA轉錄本及其蛋白水平的變化)[24]。如果研究人員克服了這些障礙，那么這樣的基因編輯技術就有可能根除cccDNA并實現HBV的完全治愈。雖然CRISPR也可以被設計成專門從人類DNA中去除整合的HBV序列，但是任何隨后的染色體易位都會產生災難性的后果[24]。

1.2 免疫類藥物

乙型肝炎患者對HBV DNA 特殊的免疫功能和對HBV DNA 的免疫耐受性，以及免疫協調功能的個體差異，使HBV在體內不能被除去。免疫類抗HBV藥物目前在研的有治療性疫苗、先天免疫系統激活藥物、單克隆抗體、檢查點抑制劑以及其他免疫途徑。

1.2.1 治療性疫苗 治療性疫苗是用于刺激免疫系統作為治療的疫苗技術。治療性乙型肝炎疫苗屬于特異性主動免疫療法，可分為蛋白質疫苗、基因疫苗和細胞疫苗三大類。臨床上普遍使用重組HBsAg 疫苗。GS-4774疫苗是利用重組釀酒酵母表達HBsAg、HBcAg和HBV X蛋白。GS-4774在病毒抑制的患者中耐受性很好，但它并沒有顯著降低HBsAg水平，即使有近一半(40%)的HBV特異性T淋巴細胞增加，影響HBcAg和HBV X蛋白[25]。

1.2.2 先天免疫系統激活藥物 有證據[26-27]表明HBV蛋白被病原體識別受體識別，包括Toll樣受體2 (TLR-2)、TLR-4和RIG-I。病毒可能已經進化出抑制病原體識別受體信號通路的機制。TLR-7、TLR-8或TLR-9刺激先天免疫應答的藥理作用正在研究中。GS-9620是美國Gilead制藥公司研發的一種 TLR-7激動劑，可刺激TLR-7 感知外來病原體存在、誘發免疫應答，提高抗病毒能力并獲得保護性免疫。GS-9620安全、耐受性良好，但對HBsAg水平無影響[26-29]。TLR-8激動劑可以在腸道淋巴組織或肝臟中刺激觸發專職抗原細胞的成熟，刺激產生的各種細胞因子可以刺激或挽救抗原特異性T淋巴細胞應答，以提高抗HBV活性。在動物模型中，TLR-8激動劑可誘導循環血細胞的先天免疫反應，而不會引起全身性的不良反應。第一個TLR-8激動劑GS-9688最近進入了Ⅱ期臨床開發[30]。

1.2.3 單克隆抗體 單克隆抗體方面，韓國Green Cross(綠十字)公司的GC1102正在進行臨床Ⅱ期試驗，在一項前瞻性研究[31]中，證明GC1102能夠降低HBsAg水平，進而獲得良好的持續病毒學應答。此外，Vir Biotech的單克隆抗體Vir-3434正處于臨床Ⅰ期階段。

1.2.4 檢查點抑制劑 在T淋巴細胞受體中，PD-1在肝臟內HBV特異性T細胞上表達最多，同時在肝細胞中PD-L1表達增加[32]。因此，PD-1和PD-L1抑制劑目前正被研究作為可能的治療CHB的方法。在首次臨床試驗中，低劑量(單劑量0.3 mg/kg)抗PD -1中可顯著降低CHB患者的HBsAg，并且有1例患者實現了完全的HBsAg血清轉換[33]。我國歌禮藥業/康寧杰瑞的一款PD-L1抑制劑ASC22，目前正處于臨床Ⅱ期。此外，Gilead的PD-L1抑制劑GS4224正處于臨床前研究階段。

1.2.5 其他免疫途徑 其他免疫類藥物有Immunocore的IMC-I109V，正處于臨床Ⅱ期。LionTCR的LTCR-H2-1，還在臨床前研究階段。

1.3 其他抗HBV藥物

除了上述介紹外，還有一些其他抗HBV藥物(附錄1)，它們的作用機制各不相同。法國Enyo Pharma公司的FXR激動劑EYP001正處于臨床Ⅱ期。來自我國亞盛醫藥的細胞凋亡誘導劑APG-1387目前正在全球范圍內開展臨床試驗，所涉及的適應證不僅有乙型肝炎，還有晚期實體瘤和血液瘤。其他還有托普泰克公司的抗HBV X蛋白D-TTK001，Regulus的MicroRNA “HBV”，EnochianBio的基因修飾細胞療法ENOB-HB-01，GemVax& KAEL的“新型肽段”GV1001和FinchTherapeutics的口服微生物制劑CP101均處于臨床前研究階段。

2 阻斷宿主因子與病毒相互作用的藥物

在細胞核內，HBV cccDNA是具有細胞染色質樣結構的單個小染色體[34-35]。HBV cccDNA是高度穩定的，并在肝細胞中持續存在。迄今為止，越來越多的證據[34-35]表明，表觀遺傳機制是造成HBV cccDNA持續性和難以清除的原因。表觀遺傳調控機制包括但不限于DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質重塑和非編碼RNA干擾[36]。慢性病毒感染的表觀遺傳治療法的研究越來越多，如人類免疫缺陷病毒、愛潑斯坦巴爾病毒[37]，表明表觀遺傳治療可能是一種有前途的治療策略。

2.1 靶向cccDNA甲基化 病毒基因組的DNA甲基化被認為是一種宿主防御機制[38]。有報道稱DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的表達增加可以促進病毒基因組的甲基化，從而在體外阻止HBV復制[39]，這表明DNMT可以用來抑制cccDNA的轉錄。但是宿主DNA甲基化已被證明是肝癌中相關腫瘤抑制基因失活的主要機制[40]，因此，在開發基于DNMT的治療方法時，應該仔細考慮阻斷HBV感染和抑制宿主腫瘤抑制基因之間的平衡。對幾種癌細胞系的研究表明，EGCG(-)可改變DNMT活性。此外，EGCG還被證明可以抑制HBV進入并誘導抗HBV自噬反應，這表明EGCG可能對HBV相關的HCC患者有益。據報道[41]，HBV感染誘導從頭甲基化，并降低抗病毒細胞因子IL- 4的表達。此外，DNMT已被證明可上調癌癥患者的細胞因子以及Janus激酶(JAK)/STAT和IFN信號通路。因此，基于DNMT的表觀遺傳治療也可能喚起HBV感染細胞和免疫細胞的先天免疫，從而系統地增強對HBV復制的抑制。

2.2 靶向cccDNA的組蛋白修飾 認識組蛋白蛋白質翻譯后修飾(protein translational modifications,PTMs)在cccDNA轉錄中的作用為抑制cccDNA提供了幾個潛在的治療靶點。盡管在cccDNA微染色體上對PTMs的全基因組繪圖顯示，轉錄活性的PTMs水平決定了cccDNA的活性[42]，而不是抑制性的PTMs；這些PTMs在宿主染色體轉錄中也發揮著類似的作用。因此，如果有cccDNA特異性的PTMs修飾劑，將為開發治療靶點帶來新的希望。在這方面，最近的一項研究[43]表明，一種多功能蛋白精氨酸甲基轉移酶優先誘導cccDNA上的H4R3me2s抑制病毒轉錄，表明某些PTMs酶可能能夠區分宿主染色體與HBV cccDNA的染色質修飾[43]。此外，Tropberger等[42]發現，HAT抑制劑C646阻斷H3K27ac和H3K122ac的組蛋白乙酰轉移酶p300/CBP，并抑制HBV轉錄，但在人原代肝細胞中沒有細胞毒性，這為表觀遺傳化合物可能代表一種新型HBV抗病毒藥物的概念提供了證據。

3 抗HBV新藥展望

HBV治療的理想終點是消除宿主中的cccDNA，或者至少是cccDNA的完全失活，這是目前抗病毒治療無法實現的。越來越多的證據支持cccDNA的表觀遺傳調控在HBV擴增中發揮重要作用。所有這些都迫切需要開發靶向cccDNA的表觀遺傳治療HBV的方法，從而阻斷宿主因子與病毒的相互作用以抑制病毒。為此，在cccDNA報告細胞系或HBV感染細胞培養系統中篩選可用的前藥或更大的化合物庫將是首要嘗試的。預計在不久的將來，cccDNA特異性的表觀遺傳機制將得到充分闡明，并開發出治療甚至治愈CHB的cccDNA特異性的表觀藥物。

針對抗HBV的單藥治療和聯合治療各有優勢，但聯合用藥可能會成為乙型肝炎治療的發展趨勢，如果將抗HBV藥物和阻斷宿主因子與病毒相互作用的藥物這樣兩個作用機制互補的藥物聯用，可能會更好阻止或延緩乙型肝炎的進展，可能會離功能性治愈乙型肝炎更近一步。但需要明確藥物如何聯合，聯合治療的最佳時機，何時停藥，停藥后能否反復及如何應對，預計未來會有更多基于不同機制的藥物聯用出現，有望成為乙型肝炎治療的新方法。值得期待的是，隨著新技術、新靶點、新療法和新長效劑型的產生，越來越多的新分子和新化合物進入到臨床階段并取得了不錯的臨床效果。相信未來，能夠治愈乙型肝炎的藥物將會出現，乙型肝炎這個難題也終將被攻克。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張曉東、趙麗娜負責提出研究選題，撰寫論文和修訂論文。

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