AMPK激動劑預處理對肝缺血再灌注損傷大鼠模型的影響及相關機制

潘寧波，張旭陽，張 玉，楊龍燦，余 曦，李繼維，唐天豪，黃 平，張 瑩

1 貴州省人民醫院 a.肝膽外科，b.信息科，貴陽 550000； 2 遵義醫科大學附屬第二醫院，貴州 遵義 563000； 3 銅仁市人民醫院 肝膽外科，貴州 銅仁 554300；4 畢節市第一人民醫院 肝膽外科，貴州 畢節 551700

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)是肝外科手術中難以避免且最嚴重的并發癥之一，嚴重阻礙了肝臟手術在臨床中的發展。有研究[1]發現，HIRI過程中必然伴隨能量代謝的紊亂，而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路作為一種維持生物能量穩定、平衡的調節器將發揮重要作用。同時有研究表明，AMPK信號通路在心[2]、腦[3]、腎[4]、肝[5]等重要器官的缺血再灌注損傷中發揮保護作用。因此，本研究使用5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)預處理，初步探討AMPK信號通路改變對大鼠HIRI的影響及可能機制，為減輕HIRI提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 54只健康SPF級SD雄性大鼠[生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001；使用許可證編號：SYXK(黔)2018-0001]，4～8周齡，220～250 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。三磷酸腺苷(ATP)、TNFα和IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。RNA提取試劑盒購自美國Ambion公司，反轉錄試劑盒及擴增試劑均購自日本TaKaRa公司。AICAR購自美國APExBIO公司。磷酸化AMPK、磷酸化mTOR及內參抗體(GAPDH)均購自美國CST，磷酸化GLUT4購自英國Abcam，MRP2抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 動物分組和模型建立 54只雄性大鼠適應性喂養1周后隨機平均分為3組,每組18只。實驗組：術前1 h腹腔注射AICAR，500 mg/kg；對照組及假手術組：術前1 h使用0.9%氯化鈉注射液(500 mg/kg)腹腔注射。HIRI模型建立(實驗組和對照組)：依照Pringle法建立HIRI模型。麻醉大鼠，取腹部正中切口，逐層進入腹腔，進腹后暴露第一肝門，用無創血管夾阻斷肝臟全部血流，阻斷30 min后松開無創血管夾，使血流重新灌注，關腹。假手術組與HIRI模型同法進腹，僅暴露第一肝門，30 min后關腹。將各組手術后大鼠置于干燥清潔的鼠籠等待蘇醒。于血流重新恢復灌注術后12、24、72 h每組隨機取6只大鼠，留取血清，存放于-20 ℃冰箱備用；剪取整個肝左葉，一部分用甲醛固定，另一部分置于液氮速凍儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.3 肝組織病理HE染色 取肝組織用甲醛固定，然后脫水、包埋制作石蠟切片，光鏡下觀察肝損傷情況。

1.4 大鼠血清指標檢測 取大鼠血清，送貴陽市金陽醫院檢驗科使用全自動生化分析儀檢測ALT、AST和TBil濃度。于-20 ℃冰箱取出待測血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNFα和IL-6。

1.5 大鼠肝組織ATP檢測 大鼠肝組織100 mg，加入裂解液充分研磨勻漿取上清液，按照ATP試劑盒說明書要求檢測。

1.6 實時熒光定量PCR(real time-PCR)檢測 取100 mg肝組織，按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA并檢測其濃度跟純度，接著將總RNA反轉錄為cDNA，隨后進行real time-PCR。使用兩步法PCR擴增標準程序：第一步95 ℃ 2 min，1個循環；第二步 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，39個循環。每個樣本重復3次。結果分析：以GAPDH為內參，2-△△CT相對定量法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western Blot檢測 取肝組織50 mg，加入蛋白裂解液冰上研磨提取總蛋白，用BCA法測總蛋白濃度；制備電泳上樣樣品并保存于-80 ℃備用。制作分離膠，取50 μg 蛋白上樣后電泳，轉到聚偏二氟乙烯膜上，封閉液封閉2 h。加入一抗磷酸化AMPK(1∶1000)、磷酸化mTOR(1∶1000)、磷酸化GLUT4(1∶2000)、MRP2(1∶800)、GAPDH(1∶1000)4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫下孵育2 h。增強化學發光法顯影曝光。Image lab 5.0凝膠圖像分析系統計算條帶的灰度值。

1.8 倫理學審查 本研究已通過貴州省人民醫院倫理委員會審查，批號：[2019]094號。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織HE染色結果 大鼠肝缺血再灌注后12、24、72 h，假手術組的肝小葉及肝細胞形態、結構正常，匯管區結構完整。缺血再灌注后12 h，對照組與實驗組大鼠肝小葉結構較假手術組紊亂，肝索斷裂，部分肝細胞出現水腫、空泡樣變性及少許壞死導致的氣球樣變，中央靜脈及肝血竇擴張、充血，肝索斷裂，實驗組輕于對照組。缺血再灌注后24 h，對照組與實驗組肝組織損傷較12 h加重，對照組見肝小葉結構紊亂進一步加重，肝細胞水腫、空泡樣變性及壞死增多，中央靜脈及肝血竇擴張、充血明顯，匯管區可見少許炎癥細胞浸潤，實驗組輕于對照組。缺血再灌注后72 h，對照組與實驗組肝組織損傷程度明顯較24 h減輕，對照組肝細胞水腫、壞死減少，中央靜脈、肝血竇擴張及充血減輕，實驗組肝損傷減輕程度明顯優于對照組(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色結果(×200)

2.2 各組大鼠血清指標比較 術后12、24、72 h，對照組ALT、AST、TBil、TNFα、IL-6均高于實驗組和假手術組(P值均<0.05)，實驗組各指標均高于假手術組(P值均<0.05)(表2)。

同組比較：術后24 h，對照組和實驗組ALT、AST、TBil、TNFα、IL-6高于術后12 h(P值均<0.05)；術后72 h，實驗組和對照組各指標均較術后24 h下降，但高于術后12 h(P值均<0.05)(表2)。

表2 三組大鼠術后12、24、72 h血清指標水平比較

2.3 各組大鼠ATP水平比較 術后12、24、72 h，實驗組肝組織ATP水平均高于對照組和假手術組，對照組均低于假手術組(P值均<0.05)(表3)。

同組比較：實驗組術后24 h ATP水平高于術后12 h，而術后72 h低于24 h(P值均<0.05)；對照組術后24 h ATP水平高于術后12 h，而術后72 h高于術后12 h(P值均<0.05)(表3)。

表3 三組大鼠術后12、24、72 h肝ATP水平比較

2.4 各組大鼠AMPK、mTOR、GLUT4、MRP2 mRNA水平比較 術后12、24、72 h，實驗組AMPK、GLUT4、MRP2的mRNA相對表達水平均高于對照組和假手術組，對照組AMPK mRNA相對表達水平高于假手術組，對照組GLUT4、MRP2 mRNA相對表達水平均低于假手術組(P值均<0.05)；實驗組mTOR mRNA相對表達水平均低于對照組和假手術組，對照組高于假手術組(P值均<0.05)。

同組比較：對照組和實驗組術后24 h,AMPK、GLUT4、MRP2、mTOR mRNA相對表達水平均高于術后12 h(P值均<0.05)。實驗組術后72 h,AMPK、GLUT4、MRP2mRNA相對表達水平均低于術后24 h，高于術后12 h，而mTOR mRNA相對表達水平高于24 h(P值均<0.05)；對照組術后72 h,AMPK、mTOR mRNA相對表達水平均低于術后24 h，高于術后12 h，而GLUT4、MRP2 mRNA相對表達水平均高于術后24 h(P值均<0.05)(表4)。

表4 三組大鼠術后12、24、72 h各蛋白mRNA相對表達水平比較

2.5 各組大鼠AMPK、mTOR、GLUT4、MRP2蛋白表達水平比較 術后12、24、72 h，實驗組磷酸化AMPK、磷酸化GLUT4、MRP2表達水平均高于對照組和假手術組，對照組磷酸化AMPK表達水平高于假手術組，對照組磷酸化GLUT4、MRP2表達水平均低于假手術組(P值均<0.05)；實驗組磷酸化mTOR表達水平均低于對照組和假手術組，對照組高于假手術組(P值均<0.05)(圖2,表5)。

同組比較：實驗組術后72 h磷酸化AMPK、磷酸化GLUT4、MRP2表達水平均低于術后24 h，高于術后12 h，而磷酸化mTOR高于術后24 h(P值均<0.05)；對照組術后72 h磷酸化AMPK表達水平低于術后12、24 h，磷酸化mTOR表達水平低于術后24 h而高于術后12 h(P值均<0.05)，而磷酸化GLUT4、MRP2表達水平均高于24 h(P值均<0.05)(圖2,表5)。

表5 三組大鼠術后12、24、72 h各蛋白相對表達水平比較

圖2 三組大鼠術后12、24、72 h各蛋白相對表達結果

3 討論

HIRI是一種涉及諸多因素、眾多環節且機制非常復雜的病理生理過程。目前的研究[6-8]發現，炎癥細胞因子、能量代謝紊亂、微循環障礙等參與了HIRI。因此，最大程度減輕HIRI是肝膽外科臨床工作和實驗研究亟待解決的問題。

AMPK是生物體內維持生物能量穩定、平衡的一種重要信號通路。已有研究[9-12]證實，HIRI時，機體攝取葡萄糖能力下降，糖酵解途徑、代謝途徑被抑制，mTOR信號通路被激活，ATP合成能力下降，導致機體能量供給不足，降低了MRP2轉運膽紅素能力，損傷肝細胞功能，加重肝炎癥反應。因此，本實驗使用AICAR預處理激活AMPK信號通路，進一步使其下游分子mTOR失活、GLUT4活化，ATP合成增加，促使MRP2轉運膽紅素而減輕HIRI。

本實驗中，對照組在HIRI早期(術后12 h)血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白較實驗組和假手術組表達水平上升，而AMPK、GLUT4、MRP2 mRNA及其蛋白較實驗組和假手術組表達降低，ATP合成下降，肝組織和肝細胞功能出現損傷，此時能量合成障礙；在HIRI中期(術后24 h)，血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白表達水平持續上升，AMPK、GLUT4、MRP2表達水平持續下降，肝組織和肝細胞損傷進一步加重，提示能量合成嚴重不足；在HIRI后期(術后72 h)，各指標變化開始回升，說明肝臟開始恢復自身代謝與合成。而使用AICAR預處理后，無論在HIRI早期、中期，還是晚期，實驗組肝組織和肝功能損傷程度均輕于對照組，血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白表達均低于對照組，ATP合成和AMPK、GLUT4、MRP2 mRNA及其蛋白變化均高

于對照組，說明AMPK活化后，抑制了下游分子mTOR表達，上調了下游分子GLUT4表達。有研究[10]證實，AMPK信號通路在調節肝組織中的GLUT4表達起著重要作用，與GLUT4的表達呈正相關，而GLUT4是主要轉運葡萄糖的分子之一，影響肝臟、骨骼肌對葡萄糖的攝取、利用以及全身能量供應，能夠改善糖代謝，提高能量生成，促進肝細胞功能快速恢復。另外，MRP2轉運膽紅素是一個主動轉運、耗能的過程，其表達高低與能量呈正相關[12]。mTOR信號通路被激活，ATP合成能力下降，導致機體能量供給不足[13]，降低了MRP2轉運膽紅素能力，加重肝臟炎癥反應。實驗組AICAR通過作用于α亞基中Thr-172位點而激活AMPK信號通路，使其下游分子mTOR失活、GLUT4活化，ATP合成增加，促使MRP2轉運膽紅素，減輕肝細胞損傷。本實驗中，隨著HIRI后時間的推移，機體逐漸恢復供能，炎癥因子逐漸被清除，肝損傷逐漸減輕，提示能量代謝途徑能減輕肝臟炎癥反應，降低HIRI程度。通過AICAR預處理的實驗組則更能促進肝臟自身合成與代謝的恢復，進而減輕HIRI。

綜上所述，AICAR預處理能激活AMPK信號通路，改善能量代謝途徑，減輕肝臟炎癥反應，從而降低HIRI程度。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：潘寧波負責課題設計，資料分析，撰寫論文；張旭陽、張玉、楊龍燦、余曦、李繼維、唐天豪參與收集數據，修改論文；黃平、張瑩負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。