術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞微RNA-192對(duì)孤立性肝細(xì)胞癌微血管侵犯的預(yù)測(cè)價(jià)值

丁雪梅，武世倫，孫文兵

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 健康體檢中心，北京 100038;2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院西區(qū) 肝膽胰脾外科，北京 100043

目前，肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)病死率位居腫瘤相關(guān)性死亡第2位，僅次于肺癌[1]。肝癌的治療首選方式仍以手術(shù)治療為主，但由于肝癌易復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后情況仍然較差[2]。研究[3]認(rèn)為，微血管侵犯(microvascular invasion，MVI)是肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)以及影響患者術(shù)后生存率的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前，對(duì)于MVI的診斷主要依靠術(shù)后病理檢查，因此尋求術(shù)前無(wú)創(chuàng)、有效的MVI預(yù)測(cè)工具，對(duì)于患者手術(shù)方式以及術(shù)后治療方案的選擇具有重要價(jià)值。外周血單個(gè)核細(xì)胞微RNA(miRNA，miR)的檢測(cè)作為近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)，成為臨床診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法之一。miRNA屬于非蛋白質(zhì)編碼的小分子RNA，miR-192基因位于11號(hào)染色體，在肝臟、結(jié)腸、腎臟等組織中表達(dá)。研究[4]顯示，miR-192與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。另有研究[5]發(fā)現(xiàn)，miR-192在腫瘤進(jìn)展以及血管侵襲方面具有重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步提高對(duì)肝癌患者術(shù)后MVI預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，本研究探討分析術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192對(duì)孤立性肝癌血管侵犯的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年3月—2020年4月在北京朝陽(yáng)醫(yī)院西區(qū)肝膽胰脾外科接受治療的肝癌患者136例，其中男78例、女58例，年齡34～79歲，平均(53.82±11.98)歲。根據(jù)術(shù)后病理檢查有無(wú)MVI分為MVI組(n=41)和非MVI組(n=95)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前B超、CT和/或MRI檢查診斷為肝癌，且無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；(2)均為首次行根治性切除術(shù)治療，術(shù)前未接受任何放療、化療以及其他治療方式；(3)術(shù)中切緣距腫瘤邊緣至少1 cm以上，且切緣陰性；(4)患者術(shù)前影像學(xué)檢查未見(jiàn)大血管侵犯；(5)臨床資料及影像學(xué)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)全身狀況差，肝功能Child-Pugh C級(jí)；(2)術(shù)前合并全身感染；(3)合并其他原發(fā)性惡性腫瘤。

1.3 術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192檢測(cè) 術(shù)前抽取患者外周血4 ml，使用EDTA-K2抗凝，使用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，使用PBS沖洗2次，將700 μl Qizol加入PBMC中混勻備用。使用Trizol試劑提取PBMC中總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按照SYBR Green EXScript TMPCR Kit操作程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用U6作為內(nèi)參基因。miR-192以及U6引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸20 s，共完成40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct計(jì)算miR-192相對(duì)表達(dá)量。

1.4 術(shù)前超聲檢查 采用LOGIQ E9型彩色多普勒超聲診斷儀，超聲探頭頻率3.5～5.5 MHz，檢查時(shí)取仰臥位，對(duì)患者肝臟、脾臟等臟器各切面進(jìn)行常規(guī)掃查，測(cè)量腫瘤的直徑，并記錄腫瘤結(jié)節(jié)類(lèi)型以及包膜情況。結(jié)節(jié)包括3種類(lèi)型：類(lèi)圓型、單結(jié)節(jié)型以及多結(jié)節(jié)型；包膜分為3種：包膜完整、包膜缺損以及無(wú)包膜。由2位高年資醫(yī)師單獨(dú)閱片后給出診斷結(jié)果，若結(jié)果不一致，則由上述2位醫(yī)師商討復(fù)核后達(dá)成一致。

1.5 MVI判斷方法 參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)》[6]明確術(shù)中病理取材部位以及數(shù)量，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定硬化后切成薄片，將其制成病理切片并進(jìn)行HE染色封片，在顯微鏡下觀察是否有MVI，即微小靜脈(包括門(mén)靜脈分支、中央靜脈或包膜外小靜脈)內(nèi)漂浮成團(tuán)癌細(xì)胞，并且周邊有明確的血管內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞。

1.6 倫理學(xué)審查 本研究由經(jīng)北京朝陽(yáng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批號(hào)：2018HL006。患者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 MVI組與非MVI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192水平比較 MVI組患者術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192相對(duì)表達(dá)量明顯低于非MVI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.798±0.164 vs 1.086±0.215，t=7.663，P<0.001)。

2.2 影響MVI發(fā)生的單因素分析 對(duì)可能影響MVI發(fā)生的各因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示：腫瘤直徑、結(jié)節(jié)類(lèi)型、包膜類(lèi)型與MVI發(fā)生有關(guān)(t=3.828、χ2=5.422、χ2=5.914，P值均<0.05)(表2)。

表2 MVI發(fā)生單因素分析

2.3 影響MVI發(fā)生的多因素分析 將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示：術(shù)前miR-192(OR=3.999，95%CI: 1.585～10.086，P=0.003)、結(jié)節(jié)類(lèi)型(OR=3.241，95%CI: 1.154～9.106，P=0.026)以及包膜類(lèi)型(OR=2.776，95%CI: 1.088～7.084，P=0.033)是影響肝癌患者M(jìn)VI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即術(shù)前miR-192偏低、多結(jié)節(jié)以及無(wú)包膜將增加MVI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(表3)。

表3 多因素logistic回歸分析

2.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192對(duì)MVI預(yù)測(cè)價(jià)值 采用ROC曲線分析患者術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192對(duì)MVI預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示：曲線下面積為0.872，敏感度為68.38%，特異度為70.59%，95%CI: 0.768～0.931，最佳截?cái)嘀禐?.858(圖1)。

圖1 術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192預(yù)測(cè)MVI的ROC曲線結(jié)果

3 討論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，研究者們對(duì)肝癌的認(rèn)識(shí)不斷深入，以往僅關(guān)注于腫瘤數(shù)目、大小以及肝外轉(zhuǎn)移、肉眼可見(jiàn)癌栓等，而現(xiàn)在，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注于MVI，并進(jìn)入了微觀腫瘤世界的研究[7]。研究[8]認(rèn)為，MVI是影響肝癌早期復(fù)發(fā)的重要因素之一，而長(zhǎng)期以來(lái)，臨床一直忽略MVI的診斷，且并未將其列入肝癌病理診斷常規(guī)指標(biāo)，也沒(méi)有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)》[6]首次提出MVI診斷標(biāo)準(zhǔn)及其取材要求，同時(shí)也明確MVI是一個(gè)病理學(xué)概念。MVI以癌旁肝靜脈或門(mén)靜脈細(xì)小分支為主，可侵犯膽管、肝動(dòng)脈以及淋巴管分支，目前文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道肝癌患者M(jìn)VI發(fā)生率在21%～63%。研究[11-12]認(rèn)為，MVI是癌細(xì)胞逐步破壞周?chē)M織的一個(gè)過(guò)程，具體可將其分為3個(gè)步驟：(1)癌細(xì)胞克隆性增生；(2)癌細(xì)胞侵犯周?chē)|(zhì)、侵入微血管、破壞內(nèi)皮細(xì)胞、形成微癌栓；(3)癌栓進(jìn)一步增大、脫落和轉(zhuǎn)移。微血管是肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要通道，MVI預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此微血管被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移第一站。

miR-192基因多在肝臟、結(jié)腸以及腎臟等組織器官中表達(dá)，研究[13-14]顯示，miR-192在多種腫瘤組織中表達(dá)水平顯著降低，被稱為腫瘤異質(zhì)性miRNA。miR-192在腫瘤組織以及正常組織中的差異性表達(dá)可用于惡性腫瘤的早期診斷，同時(shí)miR-192在腫瘤轉(zhuǎn)移、分期以及患者預(yù)后判定等過(guò)程中均有重要意義[15-16]。本研究著眼于分析術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192對(duì)孤立性肝癌MVI的預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，MVI組患者術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192相對(duì)表達(dá)量顯著低于非MVI組。與既往報(bào)道[17-18]結(jié)果相似。miR-192作為一種抑癌基因，其表達(dá)與惡性腫瘤患者腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)miR-192可能是肝癌MVI發(fā)生的調(diào)控基因之一。單因素及多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，術(shù)前超聲影像特征(包括結(jié)節(jié)類(lèi)型和包膜類(lèi)型)以及miR-192水平均為MVI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示術(shù)前miR-192水平與MVI之間具有密切的聯(lián)系。此外，采用ROC曲線進(jìn)一步分析術(shù)前外周血miR-192相對(duì)表達(dá)量對(duì)MVI的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，曲線下面積為0.872，提示術(shù)前外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-192水平檢測(cè)對(duì)肝癌患者M(jìn)VI具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。對(duì)于術(shù)前預(yù)測(cè)MVI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高的患者，提示其術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，可以給予針對(duì)性的靶向、免疫、介入治療等，密切監(jiān)測(cè)患者miR-192變化，從而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，改善患者臨床預(yù)后。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA檢測(cè)受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注，作為一種無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方式，可為疾病的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供更多的支持[19-20]。但是由于本研究納入樣本量較小，且并未針對(duì)分析不同指標(biāo)之間聯(lián)合應(yīng)用是否能夠提高診斷效能，因此下一步研究還需要擴(kuò)大樣本量，并對(duì)其可能的機(jī)制及最佳的診斷預(yù)測(cè)方案進(jìn)行分析。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：丁雪梅負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；武世倫負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，修改論文；孫文兵負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。