微RNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌預(yù)后的價(jià)值分析

黃秀紅，謝肖立，姜慧卿

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，石家莊 050000

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第6位，致死率排第4位，世界衛(wèi)生組織估計(jì)，截至2030年，全球每年將有超過(guò)100萬(wàn)死于HCC的患者[1-2]。由于HCC起病隱匿，進(jìn)展迅速且異質(zhì)性高，盡管外科手術(shù)、射頻消融、化學(xué)栓塞甚至肝移植已廣泛用于HCC治療，但HCC患者的存活率仍然較低[3-4]。由于與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程非常復(fù)雜，迄今為止尚無(wú)敏感高效的預(yù)后生物標(biāo)志物，因此，有必要探索新的能夠高效預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的生物標(biāo)志物或模型，用于HCC的診斷、預(yù)后和治療。

微RNA(microRNA,miRNA)是一類參與mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)譯或降解mRNA，繼而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能，miRNA的差異表達(dá)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]，而且多項(xiàng)研究[7-9]已經(jīng)確定miRNA模型能夠預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者的預(yù)后，比如乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌。而在本次研究中，首先從TCGA中下載HCC基因及臨床數(shù)據(jù)，隨后找出與HCC預(yù)后相關(guān)的miRNA，構(gòu)建預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，并驗(yàn)證其檢驗(yàn)效能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與整理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載HCC miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。

1.2 差異分析 利用R語(yǔ)言的limma包對(duì)HCC與正常肝組織之間的miRNA進(jìn)行基因差異表達(dá)對(duì)比分析，并設(shè)置差異倍數(shù)log2FC(fold change，F(xiàn)C)>1.0且P<0. 01。

1.3 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建 從臨床數(shù)據(jù)中提取生存信息，包括生存時(shí)間和生存狀態(tài)，與差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行整合，利用R語(yǔ)言caret包將其隨機(jī)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，利用survival、glmnet、survminer包對(duì)訓(xùn)練集進(jìn)行單因素Cox回歸分析，并設(shè)定P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后通過(guò)10倍交叉驗(yàn)證的LASSO-Cox回歸分析進(jìn)一步篩選預(yù)后miRNA，并計(jì)算每個(gè)miRNA的危險(xiǎn)比(HR)和回歸系數(shù)，基于miRNA表達(dá)水平及回歸系數(shù)的線性組合構(gòu)建與HCC預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。

1.4 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的驗(yàn)證 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型計(jì)算出訓(xùn)練集中每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分，并根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)得分值將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，采用log-rank檢驗(yàn)的Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后差異，組間差異比較時(shí)設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)在測(cè)試集中評(píng)估其穩(wěn)健性。為了評(píng)估該模型是否可以預(yù)測(cè)同一臨床分期的患者預(yù)后，對(duì)不同TNM分期的患者進(jìn)行了分層分析，將HCC患者分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)，同樣采用log-rank檢驗(yàn)的Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估高TNM組和低TNM組的預(yù)后差異，并設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的評(píng)估 通過(guò)R語(yǔ)言的survival ROC包繪制ROC曲線，計(jì)算出ROC曲線下面積(AUC)，并與傳統(tǒng)TNM分期比較，評(píng)估該模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，其中AUC> 0.7被認(rèn)為具有良好的預(yù)測(cè)效能。最后對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型和臨床特征進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析評(píng)估該模型預(yù)后獨(dú)立性，并設(shè)定P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 miRNA樣本共425例，包括375例HCC樣本及50例癌旁樣本，并將臨床數(shù)據(jù)中生存時(shí)間、生存狀態(tài)及TNM分期缺失的數(shù)據(jù)刪除，獲得臨床數(shù)據(jù)352例(表1)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC患者的臨床數(shù)據(jù)

2.2 差異表達(dá)的miRNA 利用R語(yǔ)言對(duì)HCC及癌旁組織進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析，以log2FC>1.0 且P<0.01 為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出300個(gè)差異表達(dá)miRNAs，上調(diào)基因260個(gè)，下調(diào)基因40個(gè)。

2.3 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建 將差異表達(dá)的miRNA與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行整合匹配，共得到347個(gè)樣本，利用R語(yǔ)言將其按照1∶1隨機(jī)分成訓(xùn)練集(n=175)和測(cè)試集(n=172)，對(duì)訓(xùn)練集依次進(jìn)行單因素Cox及10倍交叉驗(yàn)證的LASSO-Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析顯示，23個(gè)miRNAs與HCC預(yù)后相關(guān)(P<0.01)。然后通過(guò)LASSO回歸進(jìn)一步篩選miRNA，結(jié)果顯示9個(gè)miRNAs: hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-4652-5p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-122b-5p、hsa-miR-3677-5p、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p與HCC預(yù)后顯著相關(guān)(圖1)。

最后將LASSO回歸篩選出的miRNAs擬合到多因素Cox回歸分析，最終確定了包括hsa-miR-139-5p、hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p在內(nèi)的6個(gè)miRNAs，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式并繪制森林圖(圖2)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：hsa-miR-139-5p×(-0.001 07)+hsa-miR-1180-3p×0.001 57+hsa-miR-1269b×0.000 26+hsa-miR-3680-3p×0.162 79+hsa-miR-509-3-5p×0.002 46+hsa-miR-31-5p×0.010 67，計(jì)算每個(gè)樣品的風(fēng)險(xiǎn)得分。在這些miRNAs中，hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的系數(shù)為正，表明這些基因表達(dá)水平越高，生存期越短，而hsa-miR-139-5p的系數(shù)為負(fù)，表明該基因表達(dá)水平越高，生存期越長(zhǎng)。

2.4 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的驗(yàn)證 根據(jù)miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，計(jì)算訓(xùn)練集中每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分，再根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)得分值(n=0.918 637 4)將訓(xùn)練集分為高風(fēng)險(xiǎn)組(n=87)和低風(fēng)險(xiǎn)組(n=88)。生存曲線顯示(圖3a)高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣地，根據(jù)相同的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型及中位風(fēng)險(xiǎn)得分值(n=0.918 637 4)，將測(cè)試集中的患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組(n=81)和低風(fēng)險(xiǎn)組(n=91)，生存曲線顯示(圖3b)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：a，LASSO篩選與生存相關(guān)的miRNAs；b，與HCC患者預(yù)后相關(guān)的miRNAs的LASSO系數(shù)。

注：**,P<0.01；***,P<0.001。

隨后根據(jù)樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分排名，分別繪制訓(xùn)練集和測(cè)試集的風(fēng)險(xiǎn)圖、生存狀態(tài)圖及與HCC預(yù)后相關(guān)的6個(gè)miRNAs的風(fēng)險(xiǎn)熱圖(圖4、5)。結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后較差，且系數(shù)為正的miRNAs(hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p)表達(dá)上調(diào)，而低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后較好，且系數(shù)為負(fù)的miRNA(hsa-miR-139-5p)表達(dá)上調(diào)。

注：a，訓(xùn)練集生存曲線；b，測(cè)試集生存曲線。

將患者按TNM分期分為低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)和高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)，Kaplan-Meier曲線顯示低TNM組、高TNM組的高風(fēng)險(xiǎn)患者的生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)患者(P<0.05)，表明該模型可以預(yù)測(cè)同一臨床分期的患者預(yù)后。

注：a，訓(xùn)練集風(fēng)險(xiǎn)圖；b，訓(xùn)練集生存狀態(tài)圖；c，訓(xùn)練集風(fēng)險(xiǎn)熱圖

注：a，測(cè)試集風(fēng)險(xiǎn)圖；b，測(cè)試集生存狀態(tài)圖；c，測(cè)試集風(fēng)險(xiǎn)熱圖。

2.5 miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的評(píng)估 利用R語(yǔ)言繪制miRNA模型及TNM分期的ROC曲線并計(jì)算AUC，結(jié)果顯示訓(xùn)練集(圖7a)中，miRNA模型及TNM分期的AUC分別為0.817、0.667，測(cè)試集(圖7b)分別為0.808、0.665，及合集樣本(圖7c)分別為0.814、0.663，miRNA模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性均優(yōu)于TNM分期。

將年齡、性別、腫瘤分級(jí)、TNM分期、miRNA評(píng)分分別進(jìn)行單因素、多因素Cox獨(dú)立預(yù)后分析，單因素分析結(jié)果顯示T分期、M分期、TNM分期及miRNA評(píng)分是HCC患者預(yù)后的相關(guān)因素(P值均<0.05)(圖8a)，多因素分析結(jié)果顯示miRNA評(píng)分模型可作為HCC的獨(dú)立預(yù)后因子(P<0.05)(圖8b)。

注：a，低TNM組(Ⅰ和Ⅱ期)生存曲線；b，高TNM組(Ⅲ和Ⅳ期)生存曲線。

注：a，miRNA模型和TNM分期在訓(xùn)練集的ROC曲線；b，miRNA模型和TNM分期在測(cè)試集的ROC曲線；c，miRNA模型和TNM

注：a，單因素分析；b，多因素分析。

3 討論

原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，在各個(gè)年齡段均可發(fā)病，發(fā)病率和死亡率比較高，預(yù)后很差。目前，用于預(yù)測(cè)HCC預(yù)后主要依據(jù)傳統(tǒng)的TNM分期[10]，盡管TNM分期在惡性腫瘤的診斷和治療中起著重要作用，但由于腫瘤的異質(zhì)性和個(gè)體差異，其無(wú)法反映內(nèi)部的生物學(xué)過(guò)程和疾病進(jìn)展，因此有必要尋找一種新的能夠高效預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的生物標(biāo)志物或模型，輔助臨床工作。

在本次研究中，首先從TCGA中下載HCC的miRNA表達(dá)量及臨床數(shù)據(jù)，TCGA是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院支持發(fā)起的，包括30多種癌癥，旨在提供不同癌癥的全面基因分析并建立與臨床結(jié)果的相關(guān)性，這些數(shù)據(jù)對(duì)于癌癥的研究具有巨大的潛力，并且已經(jīng)利用這些數(shù)據(jù)取得了許多成果[11-16]。當(dāng)作者試圖從訓(xùn)練集中確定預(yù)后特征時(shí)，由于樣本量小，基因數(shù)量眾多，因此對(duì)訓(xùn)練集中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了10倍交叉驗(yàn)證的LASSO-Cox回歸分析。其中LASSO是一種創(chuàng)新的回歸變量選擇方法，在系數(shù)的絕對(duì)值之和小于一個(gè)常數(shù)的情況下將殘差平方和最小化，從而使某些回歸系數(shù)嚴(yán)格等于0，從而選擇出對(duì)因變量影響較大的自變量，是通過(guò)構(gòu)造一個(gè)懲罰函數(shù)得到一個(gè)較為精煉的模型[17]，從而減少模型的過(guò)度擬合。而交叉驗(yàn)證法是比較常用的推測(cè)估計(jì)懲罰系數(shù)λ的方法，而λ值最終是由使平均交叉驗(yàn)證誤差最小的最小化λ確定的。然后根據(jù)Cox多因素回歸分析，得出和HCC預(yù)后相關(guān)的6種miRNAs。通過(guò)回顧已發(fā)表的文獻(xiàn)[18-20]，作者發(fā)現(xiàn) miRNA的失控與HCC的發(fā)生、耐藥、預(yù)后相關(guān)，廣泛參與HCC中腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。其中hsa-miR-1180-3p、hsa-miR-1269b、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-31-5p的表達(dá)在HCC組織中上調(diào)，可能起致癌作用，hsa-miR-139-5p在HCC組織中的表達(dá)下調(diào)，可能起抑癌作用，而hsa-miR-139-5p可以通過(guò)減少SLITRK4的表達(dá)抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)[21]。然后基于回歸系數(shù)構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，計(jì)算出訓(xùn)練集中每位患者的風(fēng)險(xiǎn)得分，然后根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)得分值將其分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并在測(cè)試集中驗(yàn)證了該miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)后價(jià)值。生存曲線分析表明，訓(xùn)練集、測(cè)試集的高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線均觀察到明顯的分離(P值均<0.05)。為了檢驗(yàn)該模型預(yù)測(cè)效能，繪制了ROC曲線，并計(jì)算了相應(yīng)的AUC，將其與傳統(tǒng)TNM分期比較，結(jié)果顯示在訓(xùn)練集、測(cè)試集及合集樣本中miRNA模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性均優(yōu)于TNM分期。最后將年齡、性別、分級(jí)、分期、miRNA評(píng)分模型分別進(jìn)行單因素、多因素Cox獨(dú)立預(yù)后分析，結(jié)果顯示該miRNA評(píng)分模型可作為HCC的獨(dú)立預(yù)后因子。該模型與傳統(tǒng)TNM分期相比較，能夠更好地反應(yīng)內(nèi)在生物學(xué)進(jìn)程和疾病進(jìn)展，受主觀因素影響少，且該預(yù)測(cè)模型具有可評(píng)估性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，可與傳統(tǒng)TNM分期互補(bǔ)，共同應(yīng)用于臨床工作。同時(shí)本研究也有一定的不足，所有分析均通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)完成，以后可同時(shí)設(shè)置內(nèi)部驗(yàn)證集和外部驗(yàn)證集(如GEO數(shù)據(jù)庫(kù))驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，而且未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，這些都有待進(jìn)一步研究工作。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明:黃秀紅負(fù)責(zé)醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，下載、分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫；謝肖立負(fù)責(zé)協(xié)助論文修改；姜慧卿負(fù)責(zé)研究指導(dǎo)、論文修改。