ST細胞全懸浮培養的馴化及其培養偽狂犬病毒的工藝研究

漆世華，韓 興，秦紅剛，李晶梅，熊 亮，秦 偉，謝紅玲，鄭良益，石寶蘭，馮 釗，徐新星

(國藥集團動物保健股份有限公司，武漢 430075)

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多種家畜和野生動物以發熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種重要傳染病[1]。其中豬偽狂犬病在我國普遍流行，疫苗接種是預防和控制該病的有效手段。目前均采用轉瓶工藝生產豬偽狂犬病疫苗[2]，勞動強度大，生產效率低。生物反應器懸浮培養工藝具有生產效率高、操作簡單、可自動化控制等優點，正在成為當前生物制品研發生產的主流技術[3]。

ST細胞為豬睪丸傳代細胞系，對多種病毒敏感，如豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)和偽狂犬病毒(PRV)等，已經應用于豬瘟疫苗的生產[4]。但ST細胞是貼壁依賴性細胞，懸浮培養需要采用微載體懸浮技術[5]，工業化放大受到了其貼壁性能的限制，操作繁瑣。為利用生物反應器大規模生產偽狂犬病疫苗，本研究馴化建立了全懸浮培養的ST細胞系，并優化了全懸浮培養的ST細胞培養偽狂犬病毒的工藝參數。

1 材料和方法

1.1 細胞、病毒和培養基 ST細胞、偽狂犬病毒C株為國藥集團動物保健股份有限公司保存；DMEM/F12培養基為Hyclone公司產品；STP無血清培養基為深圳壹生科生物科技公司的產品；新生牛血清為內蒙古金源康公司產品。

1.2 質粒和轉染試劑 Siat7e基因真核表達質粒為Genecopoeia公司產品，貨號:EX-V1581-M98；轉染試劑Lipofectamine 3000和G418為Invitrogen公司產品。

1.3 主要儀器設備 搖床為美國精騏公司產品；7 L、50 L生物反應器,購于廣州齊志生物工程設備有限公司。

1.4 ST細胞全懸浮培養的馴化

1.4.1 表達Siat7e基因的穩定ST細胞系的轉染與篩選 從液氮罐中取出凍存的ST細胞，復蘇后在T25方瓶中靜止培養。待細胞長滿后，用0.25%胰酶消化分散細胞，接種至6孔細胞培養板。待細胞形成約80%的單層時，按Lipofectamine 3000試劑說明書，向6孔細胞培養板的ST細胞中轉染Siat7e基因真核表達質粒。轉染后48 h，更換含有10%牛血清、0.5 μg/mL G418的DMEM/F12培養基，此后每3 d更換一次培養基。在G418篩選壓力下培養，熒光顯微鏡下觀察，待細胞全部表達綠色熒光蛋白，將細胞用胰酶消化擴大培養，凍存細胞。

1.4.2 細胞馴化 將1.4.1獲得的細胞采用逐步更換STP培養基培養和降低牛血清的方式，讓其適應STP無血清培養基。具體操作為采用T25克氏瓶，用75%的DMEM/F12培養基(含10%牛血清)和25%的STP培養基培養細胞3代；50%的DMEM/F12培養基(含10%牛血清)和50%的STP培養基培養細胞3代；25%的DMEM/F12培養基(含10%牛血清)和75%的STP培養基培養細胞3代；直至完全適應STP無血清培養基后，將ST細胞懸液按照初始密度1.0×106/mL接種到125 mL搖瓶，置37 ℃、5% CO2、110 r/min的搖床懸浮培養，每天取樣觀察細胞形態，計數細胞密度與活性，根據細胞的生長情況更換培養基。待細胞完全適應懸浮培養后，擴大培養并凍存細胞，將其命名為STS。將STS連續傳20代，研究STS細胞生長穩定性。

1.5 STS細胞最佳接種密度確定及生物反應器培養將STS細胞分別以0.2×106/mL、0.5×106/mL和1.0×106/mL三個初始密度接種于125 mL搖瓶進行懸浮培養，每天取樣計密度與活性，確定細胞的最佳接種密度。將搖瓶培養的細胞逐步擴大培養后，按搖瓶確定的最優細胞接種密度接種7 L生物反應器，設置生物反應器培養參數為：溫度37 ℃、pH7.2、攪拌轉速75 r/min和溶氧(DO)50%，每天取樣計密度與活性，確定生物反應器懸浮培養的可行性。

1.6 STS細胞培養偽狂犬病毒工藝研究

1.6.1 細胞最佳接毒密度、最佳接毒量和收獲時間的確定 取對數生長期STS細胞，用培養基稀釋成1.0×106/mL、2.0×106/mL和3.0×106/mL 三個密度，每個細胞密度分別接種至3個125 mL搖瓶，每瓶20 mL，同時每個細胞密度分別按照接毒量為0.01 MOI、0.1 MOI、1 MOI接種偽狂犬病毒C株，置37 ℃、5% CO2、110 r/min的搖床培養，在接毒后12 h開始每隔12 h取樣，測定病毒含量，確定接毒時細胞最佳密度、最佳接毒量和最優收獲時間。

1.6.2 生物反應器培養偽狂犬病毒工藝驗證 采用上述優化的工藝參數，用50 L生物反應器驗證工藝參數的可靠性。取搖瓶培養的種子細胞，按0.5×106/mL接種到7 L生物反應器，培養體積為5 L，生物反應器培養參數為：溫度37 ℃、pH7.2、攪拌轉速75 r/min和DO為50%。待細胞密度達到4.5×106/mL時，擴大培養至50 L生物反應器，培養體積40 L，待細胞密度達到2.0×106/mL、2.5×106/mL和3.0×106/mL時，分別按0.1 MOI、0.5 MOI和1 MOI接種偽狂犬病毒，每隔12 h取樣測定病毒含量，確定病毒的增殖情況。

2 結果與分析

2.1 ST細胞全懸浮培養的馴化 將ST細胞轉染Siat7e基因真核表達質粒，G418篩選壓力下培養細胞3周，熒光顯微鏡下觀察，細胞全部表達綠色熒光蛋白(圖1)，表明獲得一株穩定表達Siat7e基因ST細胞系。采用逐步更換STP培養基培養和降低牛血清的方式，細胞能夠完全適應無血清培養。借此進行了懸浮培養的馴化，獲得了適應懸浮培養的STS細胞；按照初始密度1.0×106/mL，培養72 h，密度達到6.0×106/mL(圖2)；連續傳代20代，細胞均正常生長，穩定在5.1×106～6.6×106/mL之間，細胞傳代穩定性良好(圖3)。

A:正常ST細胞；B:熒光顯微鏡下穩定表達Siat7e基因的細胞；C：無血清培養的ST細胞A: Normal ST cells; B: Cells stably expressing Siat7e genes under fluorescence microscope;C: ST cells culture of serum-free圖1 穩定表達Siat7e基因的細胞圖片Fig 1 Cell images of stable expression of Siat7e genes

圖2 STS細胞增殖曲線Fig 2 Proliferation curve of STS Cells

圖3 STS細胞傳代生長穩定性Fig 3 STS cells growth stability of passage

2.2 STS細胞最佳接種密度確定及生物反應器培養將STS細胞分別以0.2×106/mL、0.5×106/mL和1.0×106/mL三種密度接種于細胞培養瓶中進行懸浮培養。從圖4可以看出，以0.2×106/mL細胞密度接種時，生產較緩慢，活率下降較快；以0.5×106/mL和1×106/mL密度接種，細胞最高密度差異不大，為5×106～6×106/mL。確定細胞的最佳接種密度為0.5×106/mL～1.0×106/mL，培養傳代時間為72 h～96 h。按0.5×106/mL細胞接種密度接種7 L生物反應器，培養96 h，密度達到6.1×106/mL，活率達95%，說明細胞能夠適應生物反應器懸浮培養。

圖4 不同細胞密度接種STS細胞的生長曲線Fig 4 Growth curves of STS cells inoculated with different cell densities

2.3 偽狂犬病毒懸浮培養工藝優化 接毒時采用1.0×106/mL、2.0×106/mL、3.0×106/mL三種細胞密度和0.01 MOI、0.1 MOI、1 MOI三種接毒量，用正交實驗確定最佳細胞接毒密度、最佳接毒量和收獲時間(表1)。無論那個細胞密度接種，0.1 MOI和1 MOI接毒，病毒的增殖均優于0.01 MOI接毒，而且接毒量越大，病毒增殖達到高峰的時間越短，1 MOI接毒后病毒含量24 h最高，0.1 MOI接毒后病毒含量36 h最高；關于接毒時細胞密度，2.0×106/mL和3.0×106/mL接毒，病毒增殖的高峰均不低于109.0TCID50/mL，尤其是采用2.0×106/mL密度接種0.1 MOI病毒和采用3.0×106/mL密度接種1 MOI病毒時，病毒含量最高可以達到109.4TCID50/mL。因此病毒的最佳培養工藝為2.0×106/mL密度，接種0.1 MOI病毒，接毒后36 h收獲；或者3.0×106/mL密度，接種1 MOI病毒，接毒后24 h收獲。考慮到生產實際控制準確性，確定細胞的接毒量為0.1 MOI～1 MOI，接毒時細胞密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL，收毒時間為接毒后24 h～36 h。

表1 接毒時不同細胞密度和接毒量對病毒增殖的影響Tab 1 Effects of different cell density and amount of virus inoculation on virus proliferation

2.4 生物反應器培養偽狂犬病毒工藝驗證 采用搖瓶優化的接毒工藝參數，用50 L生物反應器驗證了工藝參數的可靠性。從7 L生物反應器放大到50 L生物反應器，待細胞密度達到2.0×106/mL，2.5×106/mL和3.0×106/mL時，分別按0.1 MOI、0.5 MOI和1 MOI接種偽狂犬病毒，病毒的增殖曲線如圖5，三批病毒含量均不低于109.0TCID50/mL，最高達到109.5TCID50/mL。

圖5 生物反應器培養病毒增殖曲線Fig 5 Growth curve of virus in bioreactor culture

3 討論與結論

懸浮培養分為微載體懸浮培養和單細胞全懸浮培養，其中單細胞全懸浮培養以其無需載體、操作簡單、易于放大，成為當前懸浮培養的主流技術。但目前疫苗生產采用的哺乳動物細胞多為貼壁依賴性細胞，需要經過全懸浮培養的馴化。常用的細胞馴化方法一般先將細胞適應無血清培養，在此基礎上進行懸浮培養馴化，同時通過培養基的不斷優化，使細胞能夠無血清高密度生長[6]，但整個過程耗時較長。Siat7e基因編碼α-2,6唾液酸轉移酶，與細胞的貼壁性有關，其表達水平的提高可降低細胞的黏附性[7]。目前采用Siat7e基因轉染細胞已經成功馴化了MDCK懸浮細胞，用于流感疫苗的生產[8]。本研究將Siat7e基因轉染ST細胞，經過篩選，獲得了穩定表達Siat7e基因的ST細胞系，進而馴化得到一株可懸浮培養的STS細胞株，此株細胞能夠穩定連續傳代，連續培養20代細胞生長穩定；適應高密度生長，在無血清條件下培養，細胞最高密度可達6×106/mL，從搖瓶放大至7 L反應器，生長穩定。

在細胞培養過程中，通常會添加血清，但由于血清成分復雜，同時存在如Ca2+、Mg2+等成分會促進細胞貼壁，因此，在得到穩定表達Siat7e基因的ST細胞系后，通過逐步降低血清的方法實現了無血清培養，進一步改善了細胞的貼壁性能，從而實現了細胞從貼壁培養到懸浮培養的馴化。同時無血清培養消除了培養基中血清成分，降低了疫苗生產制造下游的純化負荷，也為疫苗的質量提升奠定了基礎。

接毒時細胞密度、接毒量和收獲時間是影響病毒增殖培養的三個關鍵因素，本研究采用STS細胞培養偽狂犬病毒，從接毒時細胞密度、接毒量、收獲時間三個方面進行工藝優化，病毒的最佳培養工藝為2.0×106/mL密度，接種0.1 MOI病毒，接毒后36 h收獲；或者3.0×106/mL密度，接種1 MOI病毒，接毒后24 h收獲。考慮到生產實際控制準確性，確定細胞的接毒量為0.1 MOI～1 MOI，接毒時細胞密度為2.0×106/mL～3.0×106/mL，收毒時間為接毒后24 h～36 h。經過50 L生物反應器3個批次的工藝驗證，培養的病毒含量均不低于109.0TCID50/ml，說明STS全懸浮細胞適合偽狂犬病毒的培養，為生物反應器大規模生產豬偽狂犬病疫苗提供了技術支撐。