血清4型禽腺病毒強毒株GY株的分離鑒定和致病性研究

侯力丹，王 嘉，劉 丹，陳曉春，翟天舒，楊承槐，楊漢春，毛婭卿*，李俊平*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)是雞、鴨等禽體內常見的傳染性病毒之一。自2015年6月以來，我國山東、河南、河北等省份的部分地區雞群中發生了以心包積液和肝臟腫大為特征的傳染病。經過大量的研究，確定該病是由血清4型的I群FAdV所引起[1]。在我國五個省市的家禽養殖場，發現至少有三種FAdV (FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E)的流行，并且在包涵體肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)和心包積水綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome, HPS)病例中的混合感染很常見[2-4]。Chen等[5]在2015-2018年收集我國15個省市共計280份病料，發現155份存在有腺病毒感染，其中FAdV-4型占比79.4%，FAdV-8a型占比13.5%，FAdV-8b型占比3.9%。

近年來，為了防控禽腺病毒病，我國通過不同的方式開展了疫苗研制工作，而在疫苗研制過程中標準化且毒力穩定的檢驗強毒株是評價疫苗的重要標準物質。本研究于2016年從山東地區發生心包積液的疑似腺病毒感染雞群中采集病料進行了病毒分離鑒定，獲得1株血清4型FAdV GY株，并對其進行了純化、鑒定、種子批的建立和致病力的測定，以期通過研制提供可靠的檢驗用強毒株，為疫苗的研制和評價奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源及樣本處理 2016年，山東某雞場疑似發生禽腺病毒感染，發病雞剖檢表現為嚴重的心包積液，呈透明的淡黃色或淺褐色，肝臟腫大、變脆、出血或壞死，采集其肝、脾等組織。將從剖檢見肝臟病變壞死病雞中采集的肝臟組織3～4 g，按肝臟組織(g)∶PBS(mL)為1∶5的比例加入無菌PBS，放入勻漿器中，經-80 ℃反復凍融3次，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，收取上清，用0.22 μm的細菌濾器過濾，分裝于1.5 mL離心管中備用。

1.2 PCR檢測與測序 提取病料樣本的DNA，用針對FAdV的Hexon基因ORF設計如下特異性引物進行PCR擴增，上游引物P1：5′-GAGATGGTGACGGAGGTG′-3′；下游引物P2：5′-AAGCGGTGACGAGGATGC-3′，目的片段大小為3139 bp。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對PCR產物送生工生物工程(上海)有限公司測序，測序結果與表1中FAdV的12種血清型參考毒株序列進行同源性比對和遺傳進化分析。

表1 FAdV的12種血清型參考毒株信息Tab 1 Information of 12 serotypes of reference strains of FAdV

1.3 病毒分離純化與鑒定 將1.1制備的樣品按5%的劑量，接種長滿單層的LMH細胞，吸附1 h后，補充含1%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃ 5%的CO2培養箱中培養，逐日觀察，72 h收獲。反復凍融3次后離心收獲上清，作100倍稀釋后，取1 mL上清加入0.5 mL氯仿，于4 ℃搖床中振搖1 h，12000 r/min離心20 min，輕輕取出離心管，吸取上層液體0.5 mL，于生物安全柜中開口放置30 min(用于揮發殘留的氯仿)備用。處理好的病毒液，再進行10倍系列稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度，每個稀釋度接種2孔長滿單層的LMH細胞板，0.1 mL/孔，吸附1 h，棄去上清，1%瓊脂糖覆蓋后，倒置培養72 h。倒置顯微鏡下觀察，在出現細胞病變的最高稀釋度孔中，選取單個細胞病變斑3個，每個斑無菌挑取至1 mL DMEM中，凍融3次后，離心取上清進行10 倍、100 倍稀釋，將原倍、10 倍、100 倍稀釋的病毒液按前述方法進行繼續克隆，上一代克隆獲得的每個克隆后續克隆挑取1個克隆，共克隆3代。最后1代每個克隆分別接種1個25 cm2的LMH細胞瓶，待細胞病變達70%以上后置-70 ℃以下保存，為C0代。純化獲得的克隆病毒按1.2方法進行Hexon PCR擴增，測序分析。

1.4 種子批的建立與檢定 將FAdV-GY株C0代毒接種2個長滿LMH單層的175 cm2細胞瓶中，每個接種1 mL，37 ℃繼續培養，待細胞病變達80%以上后-70 ℃以下保存，為FAdV-GY株 C1代。收獲的病毒按《中國獸藥典》附錄進行病毒含量測定、無菌檢驗和支原體檢驗。用制備的病毒液制備成滅活疫苗第一次免疫，皮下注射免疫3 周齡SPF雞20 只，0.3 mL/只。21 d后，將制備的病毒液10倍稀釋進行第二次免疫，每只雞點眼、滴鼻各1 滴，加肌肉注射三種途徑共0.5 mL。第二次免疫21 d后按第二次免疫的方法進行第三次免疫，第三次免疫后21 d翅靜脈采血分離血清，按《中國獸藥典》附錄3305外源病毒檢驗中雞檢查法進行抗體檢測(表2)，以確定是否存在其他外源病毒。

表2 外源病毒檢測種類及檢測方法Tab 2 Methods of exogenous virus detection

1.5 GY株致病性研究 將FAdV-GY株 C1代毒種用滅菌生理鹽水分別稀釋至病毒含量為： 106.0TCID50/0.1mL、105.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、103.0TCID50/0.1mL共4個病毒含量梯度，每個病毒含量梯度經胸部肌肉接種4、8周齡SPF雞各5只，每只0.5 mL，同時4、8 周齡SPF雞分別設生理鹽水接種對照5只。攻毒后觀察14 d，詳細記錄接種雞的發病和死亡情況，死亡雞立即進行剖檢，觀察到期后未死亡雞處死剖檢，以判定不同攻毒劑量對不同周齡SPF雞的致病性。取GY株C1代病毒液，稀釋至105.0TCID50/0.1mL，胸部肌肉注射和皮下注射兩種途徑分別接種8周齡SPF雞，每只0.5 mL，每組5只，同時設5只不接種作為對照，攻毒后觀察14 d，詳細記錄接種雞的發病和死亡情況，死亡雞立即進行剖檢，觀察到期后未死亡雞進行處死剖檢，以判定不同攻毒途徑對SPF雞的致病性。另將GY株C1代病毒液，稀釋至105.0TCID50/0.1mL，經胸部肌肉接種SPF雞20 只，每只0.5 mL，平均分2組，同時設同日齡SPF雞10只不攻毒作為對照。攻毒后1組觀察7 d，另一組觀察14 d，詳細記錄接種雞的發病和死亡情況，死亡雞立即進行剖檢，觀察到期后將未死亡雞處死剖檢，觀察發病規律和剖檢病理變化。

2 結果與分析

2.1 分離病毒的PCR檢測和測序結果 針對FAdV的Hexon基因特異性引物對病料樣品提取核酸進行PCR檢測，可擴增出約3139 bp大小的預期目的片段(圖1)，初步判斷分離物中含有FAdV。PCR回收產物測序結果與表1所列12個血清型代表毒株Hexon序列比對結果表明，分離病毒與FAdV血清4型的同源性最高，達98.7%，與同一基因型的血清10型序列同源性次之為97.4%，與其他基因型代表毒株的同源性為67.9%～76.8%，與血清4型處于同一個分支(圖2)，初步判定臨床分離病毒為I群FAdV基因C型，血清4型。

圖2 FAdV不同血清型參考毒株hexon基因遺傳進化分析Fig 2 Genetic evolution analysis of Hexon gene of different serumtypes reference strains of FAdV

2.2 病毒的分離純化與鑒定 處理后的樣品接種LMH細胞后第一代即觀察到明顯的細胞病變，約在接種后48 h后開始出現疑似細胞病變，72 h后細胞病變明顯。第一代培養物按10%劑量接種第二代后36 h 80%以上細胞出現細胞病變，主要表現為細胞圓縮、脫落、聚集成團、細胞破損(圖3)。收獲病毒液置于-70 ℃以下保存。

A: 正常的LMH細胞對照；B: 感染GY株的LMH細胞A: Normal LMH cell control; B: LMH cells infected by GY strain圖3 分離病毒在LMH細胞上導致的細胞病變Fig 3 Cytopathic effect of isolated virus on LMH cells

氯仿處理后的病毒液經3代瓊脂覆蓋篩選蝕斑，獲得3個克隆株病毒，分別命名為FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2和FAdV-GY株C0-3。純化獲得的三株病毒Hexon基因PCR擴增結果一致，均出現約3139 bp左右特異條帶(圖4)，PCR測序結果與2.1初步分離鑒定序列同源性為100%，初步說明克隆獲得的3個克隆株為同一株病毒。將FAdV-GY株C0-1克隆株病毒接種2個175 cm2的LMH單層，收獲150 mL病毒液，標記為FAdV-GY株C1代，收獲病毒的病毒含量測定結果為107.5TCID50/0.1 mL，表明實驗室分離到的FAdV-GY株病毒能適應LMH細胞。純凈性檢驗結果表明，FAdV-GY株C1代病毒液無細菌、霉菌及支原體污染。按《中國獸藥典》雞檢查法對FAdV-GY株C1代病毒液進行外源病毒檢驗，結果顯示接種SPF雞檢測抗體除禽腺病毒抗體陽性外，其它病原抗體的檢測結果均為陰性，表明FAdV-GY株C1代病毒無外源病毒污染。

M: DNA分子質量標準DL5000；1：FAdV-GY株C0-1；2：FAdV-GY株C0-2；3：FAdV-GY株C0-3；4：陰性對照M: Marker DL5000; 1: FAdV-GY C0-1; 2: FAdV-GY C0-2;3: FAdV-GY C0-3; 4: Negative control圖4 不同克隆株病毒PCR檢測結果Fig 4 PCR detection results of different cloned viruses

2.3 不同攻毒劑量對不同周齡SPF雞的致病性 用不同劑量的GY株C1代病毒液分別經胸部肌肉接種4周齡和8周齡SPF雞，攻毒后觀察14 d。試驗結果顯示，不同周齡SPF雞攻擊5×103.0TCID50/0.1mL 及以上的GY株病毒液后引起不同程度的感染和死亡，攻擊5×104.0TCID50/0.1mL的GY株病毒液可以引起5/5發病，死亡率不低于4/5。發病雞主要表現為精神不振、不愿行走、羽毛蓬松、嗜睡等；死亡雞剖檢主要表現為心包積液、肝臟出血或壞死；有臨床癥狀未死亡雞剖檢病變不明顯，部分雞出血心包少量積液或心包膜輕度渾濁；未出現臨床癥狀雞剖檢無肉眼可見病變。對照雞均無臨床癥狀和剖檢病變。結果見表3、圖5、圖6。

表3 GY株不同攻毒劑量對4周齡和8周齡SPF雞的致病性研究結果Tab 3 Pathogenicity of different challenge doses of GY strains on 4 weeks and 8 weeks SPF chickens

A: 攻毒后50 h死亡雞；B: 攻毒后72 h死亡雞；C: 發病但未死亡雞；D: 對照雞A: Dead chickens 50 h after challenge; B: Dead chickens 72 h after challenge;C: Chickens with disease but not death; D: Control chickens圖5 4周齡SPF雞攻毒剖檢照片Fig 5 Profile of challenged SPF chickens aged 4 weeks

A: 攻毒后72 h死亡雞；B: 攻毒后97 h死亡雞；C: 攻毒后120 h死亡雞；D: 對照雞A: Dead chickens 72 h after challenge; B: Dead chickens 97 h after challenge;C: Dead chickens 120 h after challenge; D: Control chickens圖6 8周齡SPF雞攻毒剖檢照片Fig 6 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

2.4 不同攻毒途徑對SPF雞的致病性 取GY株C1代病毒液分別經胸部肌肉注射和皮下注射兩種途徑接種8周齡SPF雞，每只0.5 mL(含5×105.0TCID50)，攻毒后觀察14日。結果顯示，肌肉注射途徑SPF雞發病率為5/5，死亡率為5/5；皮下注射途徑發病率為4/5，死亡率4/5。肌肉注射途徑 SPF雞的死亡時間為攻毒后2～4日，比皮下注射途徑的死亡時間(3～5日)略早，對照雞5/5正常。

2.5 發病規律和剖檢病變研究 GY株C1代病毒液經胸部肌肉攻擊8周齡SPF雞。臨床觀察結果顯示，攻毒后2～3日開始表現臨床癥狀，主要表現為精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動、閉眼嗜睡等，發病率達20/20。攻毒后24 h開始發現攻毒雞出現臨床癥狀，死亡集中在3～5日，死亡雞嚴重心包積液，肝臟有腫大、出血或壞死。攻毒后觀察7日和14日組，死亡率均為9/10。觀察7日組未死亡雞剖檢心包有明顯積液，肝臟有明顯壞死灶；觀察14日組未死亡雞臨床癥狀減輕至消失，剖檢心包未見積液，但心包有輕度渾濁，肝臟未見明顯病變(圖7)。

A 攻毒后7 d未死亡雞；B 攻毒后14 d未死亡雞A: Dead chickens 7 days after challenge; B: Dead chickens 14 days after challenge圖7 8周齡SPF雞攻毒剖檢照片Fig 7 Profile of challenged SPF chickens aged 8 weeks

3 討論與結論

FAdV是全世界家禽和野禽常見的垂直傳播性病毒之一，自1987年，巴基斯坦首次報道心包積液綜合征后[6]，美國等多個國家也相繼出現該病的報道[7]。在我國雞心包積液-肝炎綜合征的臨床病例中，血清4型最為流行。本研究在2016年也從山東某疑似感染雞群中經LMH細胞分離鑒定到一株血清4型的FAdV并定名為GY株，以期在充分觀察其致病性基礎上探索其作為標準強毒株的可能性。

FAdV的血清型眾多，不同的血清型致病性不同，因此對血清型的分離鑒定及致病性的研究顯得尤為重要。隨著分子生物學技術的發展，核苷酸序列測定與比對已被廣泛應用于FAdV的檢測與分型[7,8]。Hexon蛋白是FAdV的主要結構蛋白，通過對Hexon基因進行測序與遺傳進化比對，可準確區分FAdV不同的血清型[9]，因此常被作為FAdV基因分型的靶基因[10-11]。本研究在接種LMH細胞進行病毒分離培養基礎上進一步對該毒株的Hexon基因進行同源性比對及遺傳進化分析，發現該株病毒與其他血清4型參考株屬于同一分支，確定分離的毒株屬于血清4型FAdV。

許多FAdV可在健康禽體內復制，癥狀非常輕微或不出現感染癥狀，但有一些因素，特別是與其它病原并發感染時，FAdV可作為繼發病原引起雞群發病和死亡。特別是與雞傳染性貧血病毒等免疫抑制病毒發生混合感染后可增強FAdV的毒力，如有研究表明，在使用含有FAdV和CIAV共污染的新城疫疫苗后，CIAV能協助FAdV破壞母源抗體的保護作用，引起機體發病，而單污染則不會引起明顯癥狀[12-13]。這提示我們，要客觀評價FAdV的致病性，首先需要確保其純凈性。為此，本研究首先經3代瓊脂覆蓋篩選蝕斑，獲得3個FAdV-GY株克隆株病毒，純化獲得的FAdV-GY株C0-1、FAdV-GY株C0-2、FAdV-GY株C0-3病毒Hexon基因PCR擴增結果一致，均出現約3139 bp左右特異條帶，初步證實純化的毒株具有較好的特異性。不僅如此，本研究還嚴格按《中國獸藥典》雞檢查法對C1代FAdV-GY株病毒液進行了針對多達17種外源病毒的檢驗，證實FAdV-GY株C1代病毒無外源病毒污染，建立了純凈度高的FAdV-GY株種子批。

開發安全有效的疫苗是防控FAdV感染的當務之急，對此國內外已經有大量的研究報道[14-16]，而評價疫苗是否有效的關鍵因素之一是需要有經過毒力驗證的標準檢驗用強毒株。近期，已有多個報道對血清4型的FAdV致病性和發病規律開展了觀察[17-19]。本研究則利用經過純化和外源病毒檢測的FAdV-GY株C1代種子批對其致病性開展了系統研究，特別是從不同感染途徑和不同感染劑量等方面進行了相對全面的觀察。結果證實，經胸部肌肉注射后發病率和發病時間相對于頸部皮下注射途徑更有優勢，確定將攻毒途徑定為肌肉注射。在四個不同梯度感染劑量中，以不低于5×104.0的劑量攻毒，可引起100%的4周齡和8周齡SPF雞發病，80%以上死亡，為確保攻毒試驗結果穩定可靠，將攻毒劑量定為每只雞5×105.0TCID50。在多次實驗中，SPF雞于攻毒后2日開始有雞出現精神不振、羽毛蓬亂、不愿走動、閉眼嗜睡等臨床癥狀，出現上述癥狀后1～2 d大部分發病雞死亡，有的試驗雞未見明顯的臨床癥狀死亡，死亡雞剖檢均可見心包積液及肝臟腫大、出血或壞死等病變；對出現臨床癥狀未死亡的雞在攻毒后7日進行剖檢，亦可見典型的心包積液及肝臟腫大、出血等病變；出現臨床癥狀未死亡雞觀察至攻毒后14 d，發病雞臨床癥狀減輕或消失，心包積液及肝臟腫大、出血等病變不明顯，可見攻毒后觀察7 d未死亡雞剖檢病變更明顯。依據多次攻毒試驗臨床觀察和剖檢制定了該強毒株的發病判定標準，即出現任意一項即判為發病：(1)死亡；(2)雞只出現精神不振、羽毛蓬亂、不愿走動、嗜睡等任兩項臨床癥狀；(3)剖檢出現心包積液或肝臟腫大、出血或壞死等病理變化。

本研究完成了FAdV-GY株的分離鑒定、種子批建立、純凈性和致病性的研究，確定FAdV GY株作為攻毒用毒的攻毒途徑、劑量和發病標準，成功制備了可用于評判FAdV相關生物制品有效性的標準強毒株，為FAdV生物制品的研發奠定物質基礎。