HPLC法測定天然植物粗提物中芍藥苷含量

杜西翠，李云波，張 趁，郭艷欽，徐 丹，劉格格，王夢(mèng)雪，李淑娜，朱秋艷

(1.河北錦坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司，辛集 052360； 2.辛集市中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，辛集 052360； 3.河北省獸用中藥制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，辛集 052360； 4.河北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新驛站，辛集 052360； 5.河北省飼用天然植物提取物產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，辛集 052360；6.石家莊市匯豐動(dòng)物保健品有限公司，辛集 052360； 7.樂亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，唐山 063600)

針對(duì)目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素導(dǎo)致的藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題[1]，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一款既可以代替抗生素使用又可以提高動(dòng)物機(jī)體免疫力的新型飼料原料“黃芪白芍粗提物”。本產(chǎn)品是由黃芪、白芍等中藥材提取加工制備而成的天然植物粗提物，可以用于畜禽生長的各個(gè)階段，能夠有效減少臨床上抗生素的使用。為了控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保證產(chǎn)品穩(wěn)定、有效，研究并測定其有效活性成分的含量具有非常重要的意義。

白芍收載于《中國獸藥典》2015年版二部，為毛莨科植物芍藥的干燥根，氣微，味微苦、酸。具有平肝止痛，養(yǎng)血斂陰的功效，主治肝陰不足，虛熱，瀉痢腹痛，四肢拘攣[2]。獸醫(yī)臨床中經(jīng)常與當(dāng)歸、熟地、桂枝、白術(shù)、甘草等配伍使用，用于治療血虛、陰虛、疼痛等病癥，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷，以及苯甲酸、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、脂肪油、樹脂、糖、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、β-谷甾醇、草酸鈣、芍藥堿、牡丹酚及三萜類化合物等成分[3-4]。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根是一種傳統(tǒng)的中藥材，具有補(bǔ)氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，脫毒排膿，斂瘡生肌的功能[5]。現(xiàn)代研究表明，黃芪含皂苷、蔗糖、多糖、多種氨基酸、葉酸及硒、鋅、銅等多種成分，其中黃芪多糖是黃芪的主要有效成分[6]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7-9]，黃芪多糖的含量多采用紫外分光光度法進(jìn)行測定且組方為單一黃芪成分。復(fù)方產(chǎn)品進(jìn)行黃芪多糖含量測定試驗(yàn)缺乏專屬性，而進(jìn)行黃芪甲苷測定則需要用到不常用的蒸發(fā)光散射檢測器且含量較低不易檢測。因此，本試驗(yàn)以芍藥苷為測定指標(biāo)，測定了黃芪白芍粗提物中芍藥苷的含量，對(duì)于控制產(chǎn)品質(zhì)量和完善標(biāo)準(zhǔn)具有實(shí)用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent-1260II(配備紫外檢測器)；AUW220D型十萬分之一電子分析天平：島津國際貿(mào)易有限公司，感量0.00001 g；KH-500E型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院，含量98.7%，批號(hào)：Z0281506。黃芪白芍粗提物：河北錦坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200601，20200602，20200603。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2 供試品溶液制備 取黃芪白芍粗提物樣品搖勻，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，靜置，取上清液濾過，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm。對(duì)照品與供試品色譜圖見下圖。

圖1 芍藥苷對(duì)照品高效液相色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatogram of paeoniflorin reference substance

圖2 黃芪白芍粗提物高效液相色譜圖Fig 2 High performance liquid chromatogram of crude extract of Radix Astragali and Radix Paeoniae Alba

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取芍藥苷對(duì)照品約10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、4、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為稀釋液。照“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣對(duì)照品稀釋液和儲(chǔ)備液，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程分別為：Y=10.6017X-14.8514，(r=0.99966)，結(jié)果表明芍藥苷在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖3。

圖3 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 Standard curve of paeoniflorin

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一份對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定芍藥苷峰面積，計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD為0.75%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 Precision test results (n=6)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批產(chǎn)品，精密量取1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測分析，測定芍藥苷含量，計(jì)算芍藥苷含量的RSD為1.31%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Repeatability test results (n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取樣品1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測分析，測定芍藥苷的峰面積，計(jì)算其RSD為0.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3 Stability test results (n=6)

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品9份，精密量取1 mL，分成3組，每組3份，分別按芍藥苷的80%、100%、120%加入芍藥苷對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣進(jìn)行檢測分析，計(jì)算平均回收率為101.3%，RSD值為0.66%。表明該方法測定結(jié)果的準(zhǔn)確度高。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 4 Recovery test results(n=9)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，每批量取2份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣進(jìn)行檢測分析，記錄色譜圖，平行進(jìn)樣兩次，計(jì)算平均含量。各批次樣品的含量見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果Tab 5 Determination results of sample content

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的考察[10-14]試驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液四種流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相時(shí)出峰時(shí)間晚且理論板數(shù)太低；以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)對(duì)芍藥苷的洗脫能力強(qiáng)，出峰時(shí)間快，但在供試品中分離度不好，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰不易分開；乙腈-0.1%磷酸溶液對(duì)芍藥苷的出峰時(shí)間及供試品的分離度都有較好的表現(xiàn)。因此本試驗(yàn)選擇了乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

3.2 供試品提取溶劑考察 試驗(yàn)對(duì)乙醇、甲醇、50%乙醇、50%甲醇、乙腈-0.1%磷酸溶液五種不同提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果乙醇、甲醇、乙腈-0.1%磷酸溶液提取的樣品分離度都小于1.5，達(dá)不到要求；用50%甲醇提取的樣品雜質(zhì)峰較多，芍藥苷含量偏低；而50%乙醇作為提取溶劑時(shí)，樣品雜質(zhì)峰少，色譜圖的分離度最好，芍藥苷含量最高。因此本試驗(yàn)選擇了50%乙醇作為供試品提取溶劑。

3.3 柱溫 試驗(yàn)考察了不同柱溫對(duì)芍藥苷色譜峰分離的影響，柱溫設(shè)置為25、30、35、40 ℃。柱溫為25 ℃時(shí)出峰時(shí)間晚且峰型較差；柱溫為40 ℃時(shí)出峰時(shí)間快但供試品目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離效果不理想，分離度小于1.5；柱溫為30、35 ℃時(shí)供試品色譜峰的分離度均符合要求，無明顯差異，但考慮柱溫太高會(huì)對(duì)色譜柱造成損害，因此柱溫選擇30 ℃。

3.4 結(jié)論 采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相測定植物粗提物中芍藥苷的含量，方法易行，結(jié)果可靠，為飼料原料及其相關(guān)制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和含量檢測提供有效方法。