分散固相萃取結合UPLC-Orbitrap MS聯用測定禽蛋中五氯苯酚殘留量

吳劍平, 嚴 鳳,張 婧, 王 博，潘 娟,貢松松*，達列亞·阿合買提

(1.上海市獸藥飼料檢測所, 上海 201103；2.新疆獸藥飼料監察所，烏魯木齊 830063)

五氯苯酚又名無氯酚酸(Pentachlorophenol， PCP)，其分子式為C9HCl5O, 結構式如圖1, 是一種有機氯農藥，其作用機理是將生物代謝過程中的氧化磷酸化解偶聯, 具有廣譜生物殺傷性[1]，常用于殺菌、殺蟲、除草、落葉、木材防腐等。有文獻報道[2-3]，我國從1958 年以來主要將五氯苯酚鈉(PCP-Na)用于殺滅釘螺以控制血吸蟲病傳播，在長江中下游11個省(市)的稻田和池塘使用持續了幾十年。PCP-Na還可作為觸殺型滅生性除草劑使用于稻田，主要用于除稗草和幼草。其在1988～2000年的產量超過7000 噸，之后維持在每年約3000 噸。PCP在獲得廣泛應用的同時, 它所造成的環境問題也日益受到人們的高度重視, 有關研究也日益深入。有研究表明，PCP也是一種環境激素，其可通過食物鏈進入人體，經血液循環至全身各組織器官，大約20%可蓄積于體內，微量即可導致中樞神經系統、血液、肝腎損傷及內分泌紊亂，而且還是環境污染物二噁英的一種來源，具有強烈的致癌、致畸變作用[4-5]。因此，其于1975～1991年先后被科威特、瑞典、印度尼西亞、瑞士、新西蘭和印度全面禁用，1980～1992年陸續被奧地利(僅限科研)、中國(僅限木材防腐)、伯利茲(僅限持證者防腐) 和歐盟(僅限非公共場所) 所限用，被美國列入環境激素、優先控制污染物列表[3]。

目前,常見的檢測PCP方法主要檢測對象為木材、家具、紡織品、水體及水產品中的五氯苯酚檢測，其主要采用的儀器方法多為氣相色譜法和氣相色譜質譜聯用法[6-7]。由于PCP化學結構中苯環上連有5個氯離子和一個羥基，其分子極性很強，一般需要衍生化后才能進行氣相色譜或氣相色譜質譜聯用分析[8-10]。也有報道表明[11-13]，可以使用液相色譜質譜聯用檢測PCP，其無需衍生化，不會因為衍生化效率帶來問題。但由于其分子結構的特點，其需要較高的碰撞能量，且一般只能獲得母離子與氯離子組成的離子對，在定性時難以獲取兩個不同的碎片離子導致其方法特異性不佳。靜電軌道阱質譜是一種高分辨率質譜，其分辨率一般可以達到70000以上，這使其獲得的化合物精確質荷比和同位素離子豐度比信息具有極強的特征性[14]，可以非常準確地同時定性定量PCP。禽蛋中富含蛋白質、卵磷脂和脂肪，這些雜質不僅降低了目標物提取的效率，還極易污染檢測設備，選擇分散固相萃取技術作為前處理步驟可有效防止雜質的干擾和污染[15]，有利于更穩定、準確地獲得檢測結果。目前在禽蛋中檢測PCP，能同時實現精準識別與精確定量的方法并未見報道，而市場中卻有對禽蛋中PCP的檢測需求。高分辨質譜法能同時實現精準識別與精確定量，具有較高的靈敏度和特異性，適合禽蛋中PCP的檢測需求。

圖1 五氯苯酚化學結構式Fig 1 Structure of pentachlorophenol

1 材料和方法

1.1 儀器 Ultimate 3000RS超高效液相色譜、Xcalibur控制軟件、靜電軌道阱質譜帶ESI電離噴霧源(Q Exactive)、Xcalibur數據處理系統、高速冷凍離心機(Multifuge X1R，ThermoScientific)；精密電子天平(EX125ZH，OHAUS)。

1.2 材料、藥品與試劑 五氯苯酚對照品(天津阿爾塔科技有限公司，CAS No: 87-86-5,批號：S035895，99.9 μg/mL)，上海市定點養殖場(上海軍安特種蛋雞場)采用封閉式管理，以未檢出PCP陽性飼料進行飼喂，專門提供的一批禽蛋：雞蛋(批號：JK20190078-80)，鴨蛋(批號：JK20190070-72)，鴿蛋(批號：JK20190067-69)，甲酸、乙腈、甲醇、正己烷、異辛烷(色譜純)；酸性氧化鋁粉末(200目)，去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)。

1.3 色譜條件 色譜柱：反相分析柱(Waters T3 C18 100×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min,進樣量：5 μL，流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸，A∶B=75∶25等度洗脫，所得色譜質譜圖如圖2所示。

1.4 質譜條件 使用ThermoScientific公司的Q Exactive靜電軌道阱質譜帶ESI電離噴霧源，條件如下：ESI-模式，源電壓3300 V，鞘氣壓力330 kPa，輔助氣流速4.5 L/min，吹掃氣流速0.25 L/min，離子傳輸管溫度 350 ℃，霧化器溫度350 ℃，檢測模式為全掃描模式，掃描范圍256～276 Da，分辨率設為70000，透鏡電壓105 V，質量數提取窗口寬度MEW設為5 ppm。

1.5 前處理條件 同批次樣品分別取5個雞蛋、鴨蛋和鴿蛋，分別去殼勻漿后準確稱取2.00 g樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，充分震搖3 min，8500 r/min高速離心3 min后，精密量取1.00 mL上清液至試管中，加入1.00 mL 0.1%甲酸溶液，加0.2 g酸性氧化鋁粉末，渦旋混勻后10000 r/min離心，上清液過0.22 μm尼龍濾膜后裝入棕色進樣瓶待測。

1.6 方法靈敏度實驗 分別稱取分別稱取(2.00±0.02) g禽蛋空白樣品去殼后勻漿，各取40份于具塞離心管中，其中20份作為空白基質，另外20份依次加入己知濃度的標準工作液，制成含PCP藥濃度為0.2 μg/kg的添加樣品。按照1.5項前處理方法處理后，按1.3與1.4項儀器條件進樣分析。

1.7 基質效應實驗 稱取(2.00±0.02) g三種禽蛋空白樣品各5份，按1.5項方法處理后獲得相應組織空白基質溶液。另精密稱定標準品10±0.5 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，得100 μg/mL的標準品貯備液。取標準品貯備液用0.1%甲酸甲醇稀釋至100 ng/mL的標準品工作溶液。取適量標準品工作溶液用0.1%甲酸溶液稀釋至1 ng/mL溶劑標準品溶液，另取適量標準品工作溶液用空白基質溶液稀釋至1 ng/mL基質標準品溶液。將1 ng/mL的溶劑標準品溶液基質標準品溶液按1.3與1.4項的儀器條件進樣測試。

1.8 線性定量范圍 將100 μg/mL的PCP標準品貯備液用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋至1 μg/mL的標準中間溶液，再以禽蛋樣品按1.5項前處理方法處理所得的空白基質溶液稀釋標準中間溶液獲得0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、100 μg/kg系列基質標準工作曲線溶液，按1.3、1.4項儀器條件進樣檢測。

1.9 方法準確度與精密度 分別取3批空白雞蛋、鴨蛋和鴿蛋中添加定量限(LOQ)0.5 μg/kg，半最大殘留限量25 μg/kg，最大殘留限量50 μg/kg和2倍最大殘留限量(2MRL)100 μg/kg含量水平的PCP，進行添加回收率測定實驗。對每種禽蛋的同一批次樣品，取5枚去殼后勻漿，分別進行上述4個添加量的添加回收實驗，在一天內不同時間用同一標準曲線和一周內不同天不同標準曲線重復測定6次，取平均值，分別計算日內和日間精密度(CV%)；對3個不同批次同一添加量下的15份樣品的回收率測得結果統計其相對標準偏差作為批間精密度指標(批間RSD%)。

2 結果與分析

2.1 提取液提取效率研究 在4種基質中嘗試了多種提取液，包括純異辛烷、正己烷、酸化乙腈(含1%甲酸，V/V)、50%酸化乙腈(含1%甲酸，V/V)、1%甲酸水溶液提取。2 g空白試樣中加入1 μg/mL的標準中間溶液100 μL分別加入上述提取液進行振蕩提取，之后采用1.5項中前處理條件進行凈化，測得結果如表1。測試結果表明，五氯苯酚(pKa=4.80，logP=4.74)在酸性環境下屬于極性中強的化合物，在1%甲酸水溶液中的提取效率幾乎為0，而在酸化乙腈溶液中的提取效率超過80%，在正己烷或異辛烷這類極性小的溶劑中提取效率也低于20%。使用酸化乙腈作為提取劑還可沉淀除去樣品中的大部分蛋白質和少部分磷脂，既獲得了較高的提取效率，也能去除一部分雜質，因此選擇其作為提取劑。

表1 禽蛋中五氯苯酚提取效率研究(%)Tab 1 Research on extraction rate of pentachlorophenol added in eggs (%)

2.2 分散相基質的選擇 禽蛋中的干擾雜質主要以蛋白質和卵磷脂為主，主要通過無水硫酸鎂和氯化鈉進行鹽析，其對基質中的蛋白質和磷脂類的生物雜質也有一定的破壞和沉降能力。乙腈在提取的同時也通過改變等電點破壞雜質蛋白質結構造成其沉淀。經過酸化乙腈提取，無水硫酸鎂和氯化鈉進行鹽析后離心所得的提取液顏色偏黃，在使用0.1%甲酸稀釋后會出現渾濁現象，表明禽蛋中還含有一定量的核黃素等極性雜質會干擾后續的檢測，實驗過程中嘗試使用PSA粉末、C18粉末吸附，結果發現在吸附雜質的同時會造成提取效率的大幅下降，推測是PSA粉末或C18粉末對目標化合物也有較強的吸附能力，因此，采用酸性氧化鋁對其進行吸附，發現其可獲得較高的回收率，其比較結果見表2。最后，將經過處理的提取液通過高速離心可以將蛋白、磷脂、核黃素等沉降至下層，取上層清液即可獲得澄明清澈，雜質含量較少，適合上機分析的樣品溶液。

表2 禽蛋中五氯苯酚分散固相凈化效率研究(%)Tab 2 Research on dispersive solid phasepurify effect of pentachlorophenol added in eggs (%)

2.3 質譜條件的選擇 在嘗試使用靜電軌道阱質譜前本實驗室也嘗試使用串聯四級桿質譜對禽蛋中的PCP殘留量進行檢測，與本方法使用相同的前處理條件，儀器選用Thermo的TSQ Quantivia，ESI-模式，源電壓3200 V，鞘氣壓力340 kPa，輔助氣流速6 L/min，吹掃氣流速0.4 L/min，離子傳輸管溫度 340 ℃，霧化器溫度340 ℃，檢測模式為選擇反應監控模式(SRM)，一級母離子半峰寬設為0.4 Da，二級子離子半峰寬設為0.7 Da。串聯質譜法所得質譜圖如圖2(a)所示。其檢測限可達2.5 μg/kg，定量限可達5 μg/kg，在5～250 μg/kg范圍內線性關系良好。而本方法使用的Thermo Q Exactive為高分辨質譜，其可以通過提取精確質荷比來獲得特異性良好的色譜質譜圖，采用1.4項中儀器條件，可獲得對照品和樣品的精確質量數質譜圖如圖2(b)，以5 ppm的MEW提取Full Scan所得到的數據獲得的EIC圖如圖2(c)。

(a) PCP選擇反應監控質譜圖；(b)含PCP 0.1 ng/mL標準品(上)與雞蛋添加0.2 μg/kg(下)中全掃描質譜圖；(c)含PCP 0.1 ng/mL標準品(上)與雞蛋添加0.2 μg/kg(下)提取離子色譜圖圖2 五氯苯酚質譜圖Fig 2 Mass spectrometry of pentachlorophenol

2.4 靈敏度實驗結果 按1.6項相應步驟進行實驗，方法檢測限含量添加所得特征離子質量色譜如圖3所示，結果20個空白禽蛋樣品均未檢出陽性結果，20個LOD含量添加樣品均檢出陽性，該結果表明方法的檢出限可在95%置信區間內達到0.2 μg/kg，其S/N>3；另根據信噪比S/N>10得出定量限可達0.5 μg/kg。目前，我國和歐盟對PCP的限量標準比較嚴格，德國政府規定產品含有PCP的成份不得高于5 mg/kg，這條例應用于各種曾受PCP及PCP化合物處理過的產品，所有出口到德國市場出售的產品，必須通過以上測試。而我國相應規定PCP殘留量不得超過0.5 mg/kg(嬰幼兒用品不得超過 0.05 mg/kg)的限量，本方法靈敏度均能滿足兩者要求。

(a)雞蛋(上)、鴨蛋(中)、鴿蛋(下)空白樣品；(b)雞蛋(上)、鴨蛋(中)、鴿蛋(下)添加0.2 μg/kg圖3 禽蛋中五氯苯酚檢測限含量添加特征離子質量色譜圖Fig 3 EIC of pentachlorophenol LOD added in eggs

2.5 基質效應實驗結果 實驗所得面積均值和相對標準偏差如表3所示。實驗結果表明，雞蛋、鴨蛋和鴿蛋的基質標準品溶液與溶劑標準品相比都有不同程度的基質抑制作用，因此，后續實驗均采用基質標準曲線進行定量校正。

表3 禽蛋中檢測五氯苯酚的基質效應研究Tab 3 Study of matrix effect in determination of PCPin eggs

2.6 線性定量范圍 將所得定量通道色譜圖積分后面積以Y表示，進樣濃度以X表示，所得回歸曲線結果如表4所示，其線性相關系數r≥0.995。實驗表明，該方法檢測PCP在3種禽蛋中0.5～ 100 μg/kg添加含量范圍內線性良好。

表4 禽蛋中添加PCP的標準曲線Tab 4 Standard curve of PCP added in eggs

2.7 準確度與精密度 按1.9項進行實驗，所得實驗結果如表5所示。結果表明，添加回收率在74.43%～96.85%范圍內，批(日)內與批(日)間變異系數CV%<10%，表明該方法具有較好的準確度與精密度。

表5 方法準確度與精密度Tab 5 Accuracy and precision of the method

樣品添加量/(μg·kg-1)批次回收率/%均值/%批(日)內CV/%批(日)間CV/%鵝蛋0.52550100Ⅰ85.9684.1980.5984.0676.9383.4082.34.4Ⅱ80.2085.0579.4579.1676.2076.9880.04.0Ⅲ78.0586.7274.8979.6182.6480.5480.45.6IV84.4282.7084.2277.2276.9274.9481.14.6V83.9675.4479.2684.7385.3981.9281.85.2VI77.4374.7978.9481.8076.7677.3577.93.4Ⅰ79.5881.8088.1486.4188.9079.7185.04.8Ⅱ81.3481.0189.8386.4589.0184.0585.54.9Ⅲ79.6188.7084.7787.8682.1683.4884.64.5IV81.4483.9682.7684.6784.1184.2983.41.5V79.6186.7484.2783.4584.0589.1783.63.1VI79.5880.9589.0884.4180.5184.1582.94.7Ⅰ83.6589.0485.7790.1984.9392.8286.73.2Ⅱ91.9091.4485.6691.0587.1084.3089.43.2Ⅲ86.9490.4991.6692.9392.1686.8490.82.6IV92.9190.6887.7990.8988.4285.9490.12.3V83.4491.6292.7888.4687.0984.7888.74.2VI92.9084.7784.8090.2186.1391.2687.84.1Ⅰ94.2193.2596.7694.5391.5896.2194.12.0Ⅱ93.0492.9393.9696.4893.4395.5394.01.6Ⅲ94.7593.0793.2395.0494.5292.2294.11.0IV92.9696.1193.8593.8796.3995.5894.61.6V93.0894.7594.7193.1093.2092.3793.80.9VI92.8992.6793.1991.8393.0791.9092.70.64.53.83.51.5鴿蛋0.52550100Ⅰ85.0879.4976.9984.1083.6382.8081.94.2Ⅱ84.0483.7581.3482.9776.3974.6981.73.9Ⅲ81.4378.7678.3083.9186.9584.0381.94.4IV79.3080.1476.8481.5883.9582.8780.43.3V85.6577.1374.4381.0481.7186.3080.05.4VI82.6277.5179.4181.3785.4182.5481.33.7Ⅰ88.7388.7181.1482.2388.3889.7485.84.4Ⅱ82.6989.7387.2089.0279.7489.7585.75.0Ⅲ84.0583.2679.5188.3581.2688.6583.34.0IV80.5081.3582.1287.1189.7888.4784.24.8V87.4479.6281.5384.7181.6784.2383.03.7VI83.3379.3980.5889.5786.1488.9483.84.9Ⅰ90.9289.5984.7988.5891.3292.8289.02.9Ⅱ83.8992.5291.5489.3989.0385.4889.33.7Ⅲ86.5786.5390.9486.7191.4890.3788.42.9IV90.8885.8688.1988.0384.0190.5787.43.0V84.7888.4788.0389.4791.0686.5388.42.6VI89.3187.6387.1489.7085.4092.5487.82.0Ⅰ93.3495.4491.4694.6295.6692.7394.11.8Ⅱ96.0591.5992.3194.6294.9793.5693.92.0Ⅲ94.6593.8896.3795.9094.9593.3195.21.0IV94.6591.7395.2695.2793.5596.3794.11.6V95.6692.0093.6192.7591.7491.4793.21.7VI94.7295.5992.9795.6294.8096.1894.71.14.04.42.91.7

3 討論與結論

3.1 高分辨質譜檢測禽蛋中PCP殘留量的特點與優勢 由于五氯苯酚的結構穩定，在使用ESI源進行電離，氬氣進行碰撞碎裂時，其無法在質譜中獲得除氯離子以外的碎片，因此，其單個母離子只能獲得一個氯離子的特征離子碎片。如果單獨選取這對離子對進行分析，其特征性肯定不佳容易受到其他分子量接近的含氯化合物干擾，這也不符合歐盟EC 657/2002中對于串聯四級桿質譜進行化合物定性分析的相應鑒別點數最低要求的，其要求串聯四級桿質譜定性化合物時必須滿足擁有一個母離子和至少兩對離子對。在特征碎片離子不易獲取的條件下一般有兩種思路：一是改用其他電離源如EI源，化學電離源等，但這些源常見于氣相質譜，其方法靈敏度難以達到禽蛋中的PCP殘留檢測的要求[8-9]；二是改用HRMS，通過獲得精確質量數的分子離子峰來精準識別和準確定量。本方法選用靜電軌道阱質譜進行分析，其在m/z接近200處分辨率可達到70000，可以精確識別PCP的多個同位素組成的離子簇。通過精確質量數提取m/z =264.83678獲得響應最高，特異性最好的選擇離子流色譜圖EIC，其加合物母離子的同位素峰有多個與基峰響應接近的峰，分別選取其與對照品相應離子進行質量精度比較均小于1 ppm。參照歐盟EC 657/2002中使用高分辨質譜(HRMS)定性的判定要求，每個HRMS獲取的離子可獲得2.5IPs，須2對以上符合質量精度要求的即可符合IPs不小于4的相應要求，本方法在難以獲取具有特異性的碎片子離子時采用了該判斷依據。因此，本方法在分析禽蛋中的PCP時相比傳統的液相色譜-串聯質譜法具有更高的定性準確性與定量靈敏度。

3.2 靜電軌道阱質譜與串聯四級桿質譜在禽蛋中檢測PCP含量的比較 本實驗室同時也開發了使用串聯四級桿質譜對禽蛋中PCP進行檢測的方法，該方法采用相同的前處理流程，使用PCP的3對同位素加合物離子作為母離子，經過碰撞碎裂后獲得的氯離子作為子離子，以其中相對豐度比最高的265>35.5作為定量離子，同時滿足了定性與定量要求。兩法相比，靜電場軌道阱質譜由于是高分辨質譜，因此擁有更高的質量精度，在使用一級母離子的精確質荷比定量時相比使用單位分辨質譜的離子對更有優勢，其具有更高的靈敏度和特異性。由于PCP分子結構中只有一個苯環為母體，外接5個氯離子和一個羥基，其結構導致很難獲取除氯離子外的穩定碎片離子，因此串聯四級桿質譜在定性準確性上很容易受到質量數接近的含氯化合物干擾特異性較差，與之相比靜電軌道阱質譜在分析禽蛋中的PCP殘留時通過提取精確質量數來獲得干擾更小，信噪比更高的選擇離子流EIC圖，使其相比串聯四級桿質譜具有更高的靈敏度，和同級別的串聯四級桿質譜相比其檢測限提高了近10倍左右。

本研究建立了檢測雞蛋、鴨蛋和鴿蛋中五氯苯酚殘留量的超高效液相色譜-靜電軌道阱質譜檢測方法。前處理使用分散固相萃取法，液相部分使用超高效反相色譜柱進行分離，靜電軌道阱質譜進行定性定量分析。實驗結果表明，方法的檢測限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，在0.5～100 μg/kg范圍內線性關系良好(r>0.995)，添加回收率在74.43%～96.85%，批(日)內與批(日)間變異系數CV%<10%，表明該方法具有較好的靈敏度、準確度與精密度。