黑骨藤追風活絡膠囊對類風濕關節炎大鼠PI3K/AKT/HIF-1α 軸的影響

陳日裕

類風濕性關節炎是一種免疫性疾病,長期得不到有效的治療還會導致機體功能喪失,一旦患病,患者會出現關節疼痛、腫脹等癥狀,對患者的生活和身體健康產生了極為不利的影響［1］。目前在臨床中治療類風濕性關節炎的主要藥物依然是非幽體抗炎藥和皮質激素,這兩類藥物對患者癥狀緩解和病情改善有一定的效果,但如果持續服用此類藥物對患者身體會產生不利影響［2］。黑骨藤追風活絡膠囊中使用的黑骨藤、清風藤、追風傘均來源于苗族的民間,有9 成以上的類風濕性關節炎患者經黑骨藤追風活絡膠囊得到有效治療。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 此次研究所用的藥物包括由國藥集團老來福(貴州)藥業有限公司生產的黑骨藤追風活絡膠囊。由上海碧云天生物技術有限公司生產的PI3K 抑制劑LY294002。大鼠每日給藥黑骨藤追風活絡膠囊的劑量計算與人體120 斤體重為準,給藥量是人體一日服用藥量的7 倍。

1.1.2 動物 選用雄性SD 大鼠,體重180～220 g,均來自于長沙天勤生物技術有限公司,飼養環境為SPF級,室內溫度和濕度均按照標準調節。動物飼料統一來自長沙天勤生物技術有限公司。

1.1.3 試劑 此次實驗選用的試劑包括：由Chond-rex公司生產的牛Ⅱ型膠原；由Sigma 公司生產的完全弗氏佐劑；由Abcam 公司生產的Bcl-2、Bax、HIF-1α、Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C、β-actin 蛋白；由CST 公司生產的p-AKT、p-PI3K 蛋白；由北京中杉金橋生物技術有限公司生產的山羊抗兔HRG 抗體；由上海碧云天生物技術有限公司生產的TUNEL 染色試劑盒；由欣博盛生物科技有限公司生產的IL-2、IL-4、IL-17 ELISA 試劑盒；由北京索萊寶生物科技有限公司生產的SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 類風濕關節炎大鼠造模 選用雄性SD 大鼠若干,隨機分為空白組和造模組,將牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑配制成混合懸液,造模組大鼠在實驗前1 天和第7 天分別于尾巴根部位置經皮下注射該懸液,讓大鼠患類風濕關節炎。誘發類風濕性關節炎后,觀察大鼠足趾關節腫脹情況,并對其腫脹程度進行評分,大鼠的足踢趾均有輕微腫脹為1 分；大鼠的足踢趾均有較為明顯的腫脹為2 分；大鼠的足踢趾腫脹嚴重為3 分；大鼠的足踢趾、踩關節均腫脹嚴重或發生變形為4 分。腫脹評分為2、3、4 分的大鼠表示造模成功。造模成功的大鼠隨機分為3 組,分別為模型組、黑骨藤追風活絡膠囊組以及黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組,每組分得大鼠8 只。空白組大鼠按照其身體重量每日灌胃生理鹽水,模型組、膠囊組、聯合給藥組每日灌胃給藥羧甲基纖維素鈉配制的混懸液,膠囊組應用黑骨藤追風活絡膠囊,黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組應用黑骨藤追風活絡膠囊與PI3K 抑制劑,各組均持續5 周。最后一次給藥后對各組大鼠的足跖部厚度進行測量,于大鼠腹部主動脈采取儲存,取適量脾臟置于4%多聚甲醛,其余脾臟置于-80℃環境下儲存,同側關節滑膜組織以同樣的方式儲存。

1.2.2 后肢足踢部腫脹度測量 經厚度測量儀對炎癥誘導前后大鼠兩只后肢足踢部腫脹程度進行測量,并做好詳細登記,根據等級結果做進一步分析。

1.2.3 蛋白定量 采用BCA 蛋白定量法完成蛋白定量,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠完成濃縮膠和分離膠制備,分別為5%和12%,加入樣品之后在80 V 電壓條件下電泳,持續2 h,60 V 電壓條件下轉膜,持續2 h,將5%脫脂奶粉在封閉儲存2 h,然后加入第一抗體,內參一抗濃度為1∶8000,其余為1∶1500,用TBST 緩沖液沖洗3 次,加入濃度為1∶7000 的第二抗體,再次沖洗,置入顯影液,利用ImagePro-Plus6.0 軟件對結果進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比 治療前,模型組、黑骨藤追風活絡膠囊組、黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組的足踢趾腫脹程度均高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05)。治療后1、2、3、4、5 周,黑骨藤追風活絡膠囊組、黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組的足踢趾腫脹程度均低于本組治療前,且均低于模型組,差異均具有統計學意義(P<0.05),但仍不及空白組。見表1。

2.2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達對比 模型組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達顯著高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05)。但是黑骨藤追風活絡膠囊組和黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K抑制劑給藥組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達低于模型組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 四組大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達對比 模型組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達顯著高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05)。黑骨藤追風活絡膠囊組及黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達明顯低于模型組,而Bax 蛋白表達明顯高于模型組,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比(,mm)

表1 四組大鼠治療后不同時期的足踢趾炎性腫脹程度對比(,mm)

注：與模型組對比,aP<0.05

表2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達對比()

表2 四組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達對比()

注：與空白組對比,aP<0.05；與模型組對比,bP<0.05

表3 黑骨藤追風活絡膠囊在不同時期對類風濕關節炎大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響()

表3 黑骨藤追風活絡膠囊在不同時期對類風濕關節炎大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響()

注：與空白組對比,aP<0.05；與模型組對比,bP<0.05

3 討論

黑骨藤追風活絡膠囊由貴州同濟堂制藥有限公司生產,且為該公司的專利藥物,主要功效是活血通絡、祛風止痛等,但是針對類風濕關節炎的臨床治療機制尚無明確定論［3］。該膠囊中含有黑骨藤、清風藤、追風傘,其中黑骨藤的功效為祛風濕、通經絡、活血消炎,對風濕關節痛、跌打損傷、乳腺炎、口腔炎等有良好的治療效果；清風藤的功效為通經絡、祛風濕、利尿,對關節腫脹、風濕痹癥、水腫、麻痹瘙癢、腳氣等有良好的治療效果；追分傘的功效為活血止痛、祛風通絡［4］。對風濕麻痹、半身不遂、四肢拘攣、骨折、跌撲、小兒驚風等有良好的治療效果。相關文獻也曾對黑骨藤追風活絡膠囊的用藥安全性提出質疑,認為其有一定的毒副作用［5］。引發類風濕關節炎的因素主要是PI3K-AKT-HIF-1α 信號通路,激活PI3K 蛋白的細胞因子不僅僅局限于一種,可促進細胞分化、加強代謝和細胞活力、誘發炎癥甚至癌癥。AKT 蛋白曾經是胰島素細胞信號的存在,可以反應細胞生長、細胞增殖等情況,并于PI3K 蛋白下游激活,引發一些列蛋白反應［6］。HIF-1α 不受組織損傷影響,以含氧量為依據完成營養供應和血管增生,快速反應機體供養狀況。針對炎癥、血氧含量不足的疾病中,HIF-1α 無法正常完成降解,經轉移后結合HIF-1β,最終形成二聚體,激活下游蛋白,幫助新生血管生成［7］。

大鼠造模完成后,相較于空白組,模型組大鼠的足跖部炎性腫脹程度嚴重,膠囊組大鼠經黑骨藤追風活絡膠囊治療后,足跖部炎性腫脹情況得到明顯緩解,聯合給藥組大鼠經黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑治療后,二者的協同作用得到有效的發揮,讓炎癥難以進一步加重。模型組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達顯著高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05)。但是黑骨藤追風活絡膠囊組和黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表達低于模型組,差異具有統計學意義(P<0.05)。模型組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表達顯著高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05)。黑骨藤追風活絡膠囊組及黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑給藥組大鼠的滑膜組織p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2 蛋白表達明顯低于模型組,而Bax 蛋白表達明顯高于模型組,差異具有統計學意義(P<0.05)。說明,黑骨藤追風活絡膠囊以及黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑治療類風濕關節炎的腫脹問題雖然有一定的效果,但是無法根治。黑骨藤追風活絡膠囊以及黑骨藤追風活絡膠囊聯合PI3K 抑制劑可有效降低脾臟Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C 蛋白表達,讓大鼠的滑膜細胞加速凋亡。

綜上所述,黑骨藤追風活絡膠囊可影響類風濕關節炎中PI3K/AKT/HIF-1α 信號通路的表達,引發多種細胞和蛋白調節。