堿性成纖維細胞生長因子上調促進大鼠肌腱干細胞增殖的機制研究

王成 曹孝榮 黃哲璟 王揚劍

肌腱損傷包括各種急性損傷和慢性退行性改變[1-2]，損傷后的自然愈合是一個緩慢的過程，組織常發生纖維化，導致肢體功能受限，因此常需要手術干預和康復治療[3-4]。然而，術后肌腱由于膠原纖維的無序沉積以及瘢痕組織的形成，可導致肌腱生物力學性能喪失[3-4]。另外，肌腱漫長的重塑過程可致肌腱粘連或關節攣縮[5-6]，發生再損傷的概率也很高。因此，迫切需要提高受損肌腱的愈合效率及質量[3，5-6]，基于細胞的肌腱組織工程有望解決這一問題。肌腱來源的肌腱干細胞（tendon derived stem cells，TDSC）具有多向分化的能力，在維持肌腱穩態和損傷后修復中發揮關鍵作用，被認為是肌腱愈合較好的細胞來源之一[7-9]。在應用外源性TDSC促進肌腱愈合的研究中發現，TDSC注入體內后需要經歷存活、活化、增殖和分化等過程，合適的生長因子可促進TDSC增殖和向成纖維細胞分化[9-10]。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種多能細胞生長因子，可促進多種損傷后修復。研究發現，bFGF不僅能促進骨髓間充質干細胞的增殖、自我更新和分化，而且可刺激肌腱Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成，有利于新生肌腱獲得更好的生物力學性能[11-12]。然而以上結論是基于間充質干細胞的研究，bFGF對TDSC的作用和機制尚不明確。近年來，研究發現TDSC的生成與miRNA的差異表達相關[13]。有研究報道bFGF誘導的血管重塑通路主要調節miR-222[14]，在增生期，新血管形成是肌腱愈合的重要組成部分[15-16]。因此，本研究進一步探討bFGF對大鼠TDSC增殖的影響，并探索bFGF是否能通過影響miR-222的差異表達來發揮肌腱損傷修復的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年（8～12周齡）SD大鼠10只。大鼠自由獲取食物和水，飼養在一個12 h光-暗循環的房間。所有動物在實驗前均經過1周適應。本實驗經寧波大學醫學院動物實驗中心審批通過。

1.2 試劑和儀器 大鼠TDSC完全培養基（批號：CMR165）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；FBS、胰酶、青霉素-鏈霉素溶液、PE-CD44抗體（批號：12-0441-82）、FITC-CD14 抗體（批號：11-0141-82）、轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX均購自美國ThermoFisher Scientific公司。PE 標記抗小鼠 IgG1（批號：553873）、FITC標記抗小鼠IgG1（批號：562001）陰性對照抗體均購自美國BD公司；地塞米松（批號：D829854）、維生素C（批號：A800295）、β-甘油磷酸鈉（批號：G806967）、谷氨酰胺（批號：L810391）、胰島素（批號：I828365）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，批號：I811775）、吲哚美辛（批號：I811784）均購自麥克林試劑有限公司；NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）試劑盒及NovoStarSYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒均購自上海Novoprotein公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012S）、bFGF 大鼠重組蛋白（批號：P6348）、CCK-8試劑盒（批號：C0037）、油紅O 染色試劑盒（批號：C0157S）、成骨細胞礦化結節染色試劑盒（茜素紅S法，批號：C0148S）及阿爾新藍-核固紅染色試劑盒（批號：C0155M）均購自碧云天生物科技有限公司；miR-222抑制劑miR-222 in由上海吉瑪公司合成；Attune NxT流式細胞儀、酶標儀（Multiskan-FC）均購自美國ThermoFisher Scientific公司；7500F實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；免疫印跡成像系統購自美國UVP公司。

1.3 大鼠TDSC的原代細胞培養 采用植塊法進行原代細胞培養，成年大鼠脊椎脫臼法處死后迅速浸入75%乙醇溶液中，取大鼠后足部位肌腱組織，肌腱均勻剪碎成1 mm3大小，用少量培養基重懸組織塊，置于培養皿中，置于37℃含有5% CO2的培養箱中培養，待10 d左右大量肌腱細胞游離出來以后，使用含3% FBS的大鼠TDSC完全培養基進行培養。每3～4 d換液1次，細胞的P1～P3代用于后續的實驗。

1.4 TDSC中CD44+且CD14-細胞比例檢測 采用流式細胞術。將5×105個P3代TDSC用300 μl 1×結合緩沖液重懸，加入PE-CD44和FITC-CD14抗體，并設置同型對照管，室溫孵育45 min，PBS洗1次，12 000 g離心5 min，去上清液，500 μl結合緩沖液重懸后上流式細胞儀分析。

1.5 多向分化能力檢測 將P3代TDSC懸液以5×103個/cm2細胞濃度接種至6孔培養板中，至細胞完全融合，在TDSC完全培養基基礎上分別加不同誘導液，包括成脂肪誘導液（含10 mM 胰島素、500 μmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、400 mmol/L吲哚美辛），成骨誘導液（含1 nmol/L地塞米松、50 mmol/L維生素C、20mmol/L β-甘油磷酸鈉）和成軟骨誘導液（含0.5 μmol/L地塞米松、100 mg/L維生素C、10%胰島素-轉鐵蛋白-硒、50 mg/L脯氨酸、100 mg/ml丙酮酸）。同時取完全培養基作為對照組，每3 d換液1次。28 d后采用Western blot法分別檢測成脂肪細胞標志蛋白[過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）和脂肪酶（Adipsin）]、成骨細胞標志蛋白[骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OC）和 ALP蛋白]和成軟骨細胞標志蛋白[聚集蛋白聚糖（aggrecan，Agg）、X型膠原蛋白（collagen type X，CollX）、Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Coll Ⅱ）]。同時對成脂細胞進行油紅O染色（具體方法參照碧云天油紅O染色試劑盒說明書），成骨細胞進行茜素紅S染色（具體方法參照碧云天成骨細胞礦化結節染色試劑盒說明書），成軟骨細胞進行阿爾新藍法染色（具體方法參見碧云天阿爾新藍-核固紅染色試劑盒說明書）。

1.6 蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。培養皿放于冰上，棄去培養基，預冷PBS漂洗細胞2次，加入RIPA裂解液，冰上裂解細胞5 min，收集細胞裂解物，1 ml注射器吹打以破壞DNA。取3 μl進行BCA蛋白定量，剩余樣本加入上樣緩沖液后95℃下孵育10 min，儲存于-20℃備用。制備10% SDS-PAGE凝膠，每孔加入40 μg蛋白，電泳分離蛋白質后，恒定電流將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗，4℃孵育過夜，加入內參抗體β-actin并在室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜3次。加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。加入ECL發光溶液，并在UVP化學發光凝膠成像系統中顯影，蛋白條帶通過Image J軟件進行灰度值量化。

1.7 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。細胞消化后計數，以每孔5 000個細胞接種于96孔板中，24 h后加入終濃度為 1、10、100、1 000、10 000 μg/L 的 bFGF，每組3個復孔，設置不加bFGF的TDSC為對照孔。置于37℃恒溫培養箱中培養48 h，加入20 μl CCK-8溶液，37℃培養箱孵育4 h后，酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD）值，計算細胞增殖率。細胞生長曲線，在TDSC中加入1 000 μg/L bFGF（bFGF組）后，以不做任何處理的TDSC作為對照組，分別于第1、3、5、7天進行細胞計數。

1.8 細胞克隆形成能力檢測 采用平板克隆形成法。細胞接種密度為500個細胞/cm2，對照組在完全培養基中培養，bFGF組用含1 000 μg/L bFGF的培養基培養，連續培養10 d后結晶紫染色，50個細胞以上為1個克隆，計數克隆數。

1.9 細胞轉染 取對數生長期且生長狀態良好的正常TDSC，按5×105細胞/孔接種在6孔板中，分為TDSC組、TDSC+bFGF組、TDSC+miR-222 in組和 TDSC+bFGF+miR-222 in組4組。TDSC組（空白對照）在完全培養基中培養；TDSC+bFGF組在含有1 000 μg/L bFGF的培養基中培養；TDSC+miR-222 in組轉染miR-222 in后在完全培養基中培養；TDSC+bFGF+miR-222 in組轉染miR-222 in后在含有1 000 μg/L bFGF的培養基中培養，每組設置3個復孔。使用Lipofectamin RNAiMAX進行轉染。第1、3、5、7天取出培養箱中的細胞，CCK-8法檢測細胞增殖能力（參照方法1.7），繪制細胞生長曲線。

1.10 miR-222表達水平檢測 采用qPCR法。用不同濃度 bFGF（0、100、500、1 000 μg/L）處理 TDSC 24 h，收集細胞，Trizol法提取細胞RNA后，使用NovoScript1st Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后，按照NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒操作說明書檢測miR-222表達水平。以U6為內參，用2-ΔΔCt計算miR-222的相對表達量，每個樣品進行3次重復測試。使用的引物如下：miR-222正向引物：5'-GCTCAGTAGCCAGTGTAG-3'，反向引物：5'-GAACAT GTCTGCGTATCTC-3'；U6 正向引物：5'-TGGAACGCT TCACGAATTTGCG-3'，反向引物：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。TDSC細胞轉染miR-222 in后的miR-222表達水平也依照上述方法進行檢測。

1.11 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。所有實驗均單獨重復3次。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠TDSC的建立和鑒定 應用植塊法在第3～4天即可看到有細胞從組織塊周圍生長出來；細胞培養第7天，即可在鏡下觀察到呈集落樣生長的TDSC，部分細胞細長，呈纖維狀；隨后在第20天細胞增殖進入平臺期（圖1a-c）。流式細胞術檢測TDSC中CD44+且CD14-細胞比例為91.83%（圖1d）。對TDSC進行成脂肪細胞誘導，結果顯示油紅O染色后有大量的油脂（紅色部位）生成（圖2a，見插頁）；對TDSC進行成骨細胞誘導，結果顯示茜素紅S染色后有大量的鈣沉積（橙色部位）（圖2b，見插頁）；對TDSC進行成軟骨細胞誘導，結果顯示阿爾新藍染色后有大量的軟骨細胞陽性顯色（藍色部位）（圖2c，見插頁）。分別對對誘導后成脂肪細胞的標志蛋白（PPAR-γ2、LPL、Adipsin）、成骨細胞標志蛋白（OPN、OC、ALP）及成軟骨細胞標志蛋白（Agg、Coll X、Coll Ⅱ）進行檢測，不同類型細胞標志性蛋白均呈陽性表達，提示誘導分化成功（圖2d-f，見插頁）。

圖1 大鼠肌腱干細胞（TDSC）原代培養建立以及細胞純度分析（a-c：TDSC培養中細胞形態；d：流式細胞分析TDSC中CD44+且CD14-細胞比例）

圖2 大鼠肌腱干細胞（TDSC）誘導分化為成脂肪、成骨和成軟骨細胞的能力[a：誘導成脂肪細胞后，油紅O染色確定細胞脂肪滴水平，×200；b：誘導成骨細胞后，茜素紅S染色確定細胞鈣沉積水平，×200；c：誘導成軟骨細胞后，阿利新藍染色檢測軟骨誘導效果，×200；d：成脂肪細胞相關蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和脂肪酶（Adipsin）表達的凝膠成像圖；e：成骨細胞相關蛋白骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OC）和ALP蛋白表達的凝膠成像圖；f：成軟骨細胞相關蛋白聚集蛋白聚糖（Agg）、Ⅹ型膠原蛋白（CollⅩ）、Ⅱ型膠原蛋白（Coll Ⅱ）表達的凝膠成像圖]

2.2 bFGF對大鼠TDSC增殖和克隆形成能力的影響bFGF可以刺激TDSC的增殖，當1 000 μg/L bFGF作用于TDSC時，細胞增殖率達到最高，為160%，見圖3a。bFGF可明顯促進細胞增殖，第7天時細胞增殖水平達到最大，OD值為0.635±0.036，高于對照組的0.420±0.026，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3b。bFGF 可促進TDSC克隆形成，作用10 d后bFGF組形成更多的克隆（圖 3c）。bFGF 組克隆數為（75±4）個，多于對照組的（50±5）個，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 3d。

圖3 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對大鼠肌腱干細胞（TDSC）增殖和克隆形成能力的影響（a：不同濃度bFGF作用于TDSC后細胞增殖率比較；b：1 000 μg/L bFGF作用于TDSC后對細胞生長曲線的影響，與對照組比較，*P＜0.05；c：作用10 d后，bFGF對TDSC克隆形成能力的影響；d：bFGF組和對照組細胞克隆數比較，與對照組比較，*P＜0.05；OD為吸光度）

2.3 bFGF對miR-222過表達或抑制的TDSC的增殖能力和miR-222表達的影響 隨著bFGF濃度的增加，TDSC 中 miR-222相對表達量增加（P＜0.05）；與 0 μg/L比較，500、1 000 μg/L bFGF 處理后 TDSC 中 miR-222相對表達量均增加（均P＜0.05），見圖4a。miR-222 in可明顯降低TDSC中miR-222相對表達量（P＜0.05），見圖4b。與TDSC組比較，TDSC+miR-222 in組細胞增殖變慢，而TDSC+bFGF+miR-222 in組在加入bFGF后則可以恢復miR-222 in對細胞的抑制效應，見圖4c。

圖4 堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對miR-222過表達或抑制的大鼠肌腱干細胞（TDSC）的增殖能力和miR-222表達的影響（a：不同濃度bFGF處理的TDSC中miR-222相對表達量比較，與0 μg/L比較，*P＜0.05；b：轉染miR-222 in后，qPCR檢測TDSC中miR-222相對表達量，與TDSC比較，*P＜0.05；c：加入bFGF和miR-222 in后對TDSC生長曲線的影響；OD為吸光度）

3 討論

TDSC是一種多能干細胞，在維持肌腱穩態和恢復中發揮重要作用[17]。由于TDSC是肌腱組織的來源，因此特別適用于肌腱和肌腱-骨交界處的修復。此外，與其他組織分離的非造血成體干細胞相比，它們還具有更高的產量、集落形成能力、增殖能力和多向分化潛能。本研究中，使用地塞米松、維生素C等化合物誘導大鼠TDSC，誘導后可分別得到成脂肪、成骨、成軟骨細胞，說明大鼠TDSC具有較好的多向分化潛能。TDSC作為肌腱組織的固有細胞，可更好地適應肌腱微環境，并優先分化為肌腱細胞[18]。Guo等[17]發現，與骨髓來源的間充質干細胞相比，TDSC可能有更好的肌腱組織特異性和分化特性。Chen等[19]研究結果表明，將新型殼聚糖支架植入TDSC可以加速肌腱愈合，為肌腱再生提供了一種基于干細胞的新策略。

近年來，研究人員嘗試將生長因子、細胞療法與傳統醫療手段相結合來實現無瘢痕肌腱組織再生，擬解決成人肌腱在損傷后不能自我再生的問題。如利用生長分化因子5可促進肌腱干細胞的肌腱分化，轉化生長因子-β1和胰島素樣生長因子-1可增加TDSC的增殖并有利于表型維持。bFGF在損傷肌腱處初始愈合過程中升高，這預示著bFGF可能在肌腱愈合的早期發揮重要作用[20]。本研究發現，bFGF可以刺激TDSC的增殖，與未加bFGF的TDSC相比，最高可達到160%的增殖率。同時bFGF也促進了TDSC的克隆形成能力，克隆形成能力主要反映單個細胞增殖能力，一定程度上可以反映細胞存活能力。目前關于bFGF對TDSC的增殖影響研究較多[21-22]，但其具體發揮作用的機制尚不完全清楚。

近年來的研究表明，miRNA在干細胞分裂和分化中起著至關重要的作用。例如，miR-138和miR-23b[23]在干細胞成骨和成軟骨自我更新和分化過程中發揮重要作用。血管內皮生長因子通過抑制microRNA-205-5p的表達促進肩袖撕裂肌腱骨愈合[24]。但關于bFGF是否是通過調控miR-222來促進TDSC增殖的相關研究還未見報道。研究顯示，miR-222在bFGF誘導的血管重塑通路中主要調節miRNA[14]。同時miR-222可影響人造血干細胞分化[25]。本研究也發現，bFGF可上調miR-222表達，如果抑制miR-222表達，則會削弱由bFGF誘導的促細胞增殖作用。本研究結果提示，bFGF通過上調miR-222促進大鼠TDSC的增殖能力，miR-222可能在大鼠TDSC增殖中發揮重要的調節作用。因此，bFGF/miR-222可能是肌腱修復發展過程中的重要途徑，可能成為肌腱損傷修復治療的新靶點。