循環腫瘤細胞的分離與鑒定研究進展*

張 偎 綜述，徐克前 審校

1.中南大學湘雅醫學院醫學檢驗系，湖南長沙 410013；2.中南大學湘雅三醫院檢驗科，湖南長沙 410013

高效分離和準確鑒定循環腫瘤細胞(CTC)對腫瘤的早期診斷具有重要意義。目前，CTC的分離方法按原理可以分為物理分離和免疫分離兩大類，且各自分為許多亞類。分離后的細胞通常需要進一步鑒定分析，這是因為單純依靠分離方法捕獲的細胞純度較低，混雜了許多白細胞。通過對細胞表面分子標記、內部核酸等進行定性、定量分析，不僅能夠得到高純度的CTC，還可以根據細胞分型的結果鑒別不同來源的腫瘤，為腫瘤的轉移、用藥和監測提供可靠的幫助。現對CTC的分離和鑒定方法進行綜述。

1 CTC的分離

1.1物理分離方法 物理分離方法也稱為“無標簽分離”，目前主要有密度梯度離心法、基于細胞大小分離法，以及與電學、聲學、光學分離相結合的微流控技術。

1.1.1密度梯度離心法 CTC核質比較高，根據沉降系數的差異可將CTC分離開。目前開發出的平臺主要有Ficoll-Hypaque、Percoll和OncoQuick。Ficoll-Hypaque分離范圍較窄，多用于分離外周血單個核細胞，而Percoll利用不同濃度的離心劑，大大拓寬了分離范圍。帶有多孔篩的OncoQuick有效減少了白細胞污染[1]。密度梯度離心法操作簡單、成本低，但分離純度低，一般作為預富集方法。

1.1.2基于細胞大小分離法 CTC與血細胞相比體積通常較大，根據此差異可分離細胞。ISET、ScreenCell、Parylene-C、FMSA、CellSieve、3D鈀濾光片、鎳微孔篩等平臺均為微孔過濾裝置，平臺間的差異主要體現在濾膜材料、孔徑大小上，各類微孔濾膜的比較見表1。這些平臺分離出的細胞可以幫助監測疾病的進展。如通過CellSieve微濾器分離結直腸癌切除術后患者肺靜脈血液中的CTC，可及早發現結直腸癌的肺部轉移[2]；通過分析CellSieve膜上捕獲的細胞，發現循環癌基質細胞和CTC的區別及兩者與腫瘤進展的相關性[3]。微孔濾膜法捕獲效率高，但體積較小,有變形性的CTC可能被漏檢。

新發展的鐵流體動力學細胞分離(FCS)并不像大多數傳統方法一樣在膜上進行，而是利用生物相容性的鐵磁流體，對不同大小的細胞進行分離[4]。在癌細胞加標率約為每毫升100個的情況下，對肺癌、乳腺癌、前列腺癌來源的多種癌細胞系進行富集分離，平均捕獲率達92.9%[5]。FCS具有較高的生物相容性，細胞活力不受影響，但該方法仍無法從癌癥患者的血液中富集低濃度的CTC。

表1 各類微孔濾膜的比較

1.1.3微流控技術 微流控技術利用細胞慣性差異來分離細胞，不同質量的細胞在流動過程中產生不同的方向和速度。質量較大的CTC主要受慣性升力作用向內壁移動，而質量較小的血細胞主要受迪安流影響向外壁遷移。為提高分離效果，通道可設計成不同的形狀。如Vortex通道設計為直線形，ClearCell FX通道設計為對細胞活性更友好的螺旋形，而CTC-ΔChip平臺采用出口逐漸加寬的楔形設計，有效解決了出口堵塞問題。EDD 等[6]還報道了一種可用于分離CTC簇的微流體通道，該裝置以30 mL/h的速度將CTC簇捕獲在載玻片大小的裝置上。

微流控技術近幾年來發展迅速的一個重要原因是它可以與許多分離方法聯合使用，如電場分離、聲場分離、光學分離，在實現快速分離的同時有效保留細胞生物活性。ApoStream和LIFF是與電場分離相結合的微流控裝置，細胞介電特性的差異使CTC向帶有電極的方向移動，而血細胞被排斥流向洗脫液[7]。LIFF在原有的基礎上增加了電極數目，提高了分離速度[8]。Acoustic Chip是與聲學分離相結合的微流體裝置，產生駐波的壓電轉換器是設備的關鍵組件，不同體積和密度的細胞在聲場中產生不同的壓力節點而被分離[9]。光學分離根據折射率差異提示細胞間的差異，如流式細胞儀的前向散射光可反映細胞體積大小，側向散射光可反映細胞內容物、核含量等信息，但該方法分離的細胞群常有交叉，需要質控和定期校正。

1.2免疫分離方法 免疫分離方法主要通過抗原抗體、適配體等免疫相關物質之間的特異性結合達到分離的目的。

1.2.1磁場中分離 在磁性載體上包被特異性抗體或適配體，利用外加磁場的作用分離細胞，根據載體靶向細胞的不同，可分為正向和負向兩種富集策略。

基于正向富集建立的平臺有Cellsearch、MACs等，其中Cellsearch已被廣泛應用。但腫瘤在轉移過程中容易發生上皮間質轉化，導致上皮細胞黏附因子(EpCAM)低表達甚至不表達，因此，其他分子標記也正被逐步應用到CTC的分離中。如在磁納米粒子上包被脂質體和衍生物[10]及EpCAM和N-鈣黏附蛋白[11]或表皮生長因子受體(EGFR)[12]的雙抗體，有效提高了不同腫瘤CTC的捕獲效率。

正向富集法的另一個缺點在于分離過程中可能丟失分子標記，不利于后續鑒定分析和細胞培養，此時，負向富集法的優勢得以顯現。負向富集法建立的平臺有Cyttel、EasySep、MagSweeper等。其中，Cyttel、EasySep以磁珠為載體，MagSweeper利用磁性棒作為載體以減少非特異吸附。雖然負向富集法可以有效解決漏檢的問題，但捕獲純度有待提高。

1.2.2流動相分離 流動相分離CTC可分別在體外和體內進行。CTC的體外分離主要是通過微流控芯片來實現，捕獲的細胞可直接在芯片內計數與鑒定，也可以通過洗脫收集細胞。出現早且應用廣的平臺有CTC-Chip、HB-Chip、CTC-iChip和Nanovelcro芯片等。CTC-Chip易造成樣品堵塞；HB-Chip由于采用了透明材料，可用于高分辨率成像；由兩個模塊構成的CTC-iChip有較高的捕獲純度效率；Nanovelcro芯片以納米纖維為捕獲基質，極大提高了捕獲效率。有報道利用激光顯微切割系統分離Nanovelcro芯片捕獲的單個CTC，發現肺腺癌與間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排[13]和EGFR突變[14]有較強的相關性，可以有效監測疾病進展和耐藥反應。

最近也出現了一些新的微流控檢測平臺，這里報道一種二維分選裝置，它對細胞表面標志物進行兩次分型，從而精細化地將細胞分選為不同亞群，可以有效評估腫瘤的轉移、惡化[15]。由于分離過程中的血細胞干擾是較大的影響因素，LI等[16]制造了紅細胞膜模擬表面的捕獲基質以吸附血細胞，并利用靶向配體的連接實現Hela細胞的高捕獲率(91%)和高純度(89%)。

高科技的發展也推動了體內分離技術的進步，但目前出現的裝置并不多，主要是CellCollector和微型電機。CellCollector是涂覆有EpCAM抗體的醫用不銹鋼絲，將鋼絲置于靜脈血管內30 min即可捕獲CTC[17]。微型電機以腫瘤患者體內的H2O2作為推進能源，電機表面涂覆抗體快速定位靶細胞[18]。體內富集方法無需采血，保證了充足的樣本來源，但影響因素多，如存在高脂血癥、黃疸等導致的非特異吸附問題，其安全性也還需進一步驗證。

2 CTC的鑒定

目前，鑒定CTC的方法主要有免疫熒光染色法、核酸分析法、光譜分析法及蛋白質分析法。

2.1免疫熒光染色法 免疫熒光染色法利用熒光素標記對細胞進行鑒定，常用的細胞標記有核染色(DAPI、Hoechst)、上皮細胞表面抗原(CKs)、間充質蛋白和白細胞分化抗原(CD)等。許多新的標志物也不斷被學者應用到腫瘤的研究中，以往的研究發現高表達CD44、CD47的腫瘤細胞有更強的遷移和侵襲能力，這些細胞標志物可以幫助患者選擇用藥以提供精準的治療方案，如GUIBERT等[19]檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織和細胞的程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)水平，以篩選可用于免疫檢查點抑制劑治療的患者，熒光顯微鏡、自動化圖像識別設備和多參數的流式細胞分選系統可以用來觀測熒光染色結果。熒光顯微鏡適用于樣本量較小的研究，CellSearch即是通過此種方法鑒定CTC，但存在人工鏡檢造成的主觀偏倚。自動化圖像識別設備克服了上述缺點，捕獲的細胞經光纖陣列掃描后，傳感器將圖像呈遞給軟件進行處理，常應用于芯片、膜等固體化捕獲裝置的成像分析，但該方法要求固相載體保持一定清潔度，且細胞為單層排列。多參數流式細胞分選系統使用多種細胞表面標記，在鑒定細胞表型的同時可以高效分選細胞，SEN等[20]利用流式分選系統實現了多種腫瘤細胞系的分離。

2.2核酸分析法 檢測細胞內部核酸的核酸分析法主要以分子雜交、PCR和基因測序為代表。

分子雜交法利用生物探針與細胞核酸雜交可對細胞定性、定位。Canpatrol通過與捕獲細胞的mRNA分子雜交，檢測準確度達80%。最近報道的一種TPN生物探針，能夠滲透進入活細胞與線粒體特異結合，根據線粒體的發光差異來區分腫瘤細胞和血細胞[21]。這種探針對細胞活力和完整性影響很小，可以作為鑒定CTC的新工具。

OncoCEE和AdnaTest應用實時熒光定量PCR技術，通過檢測多種乳腺癌相關基因來評估轉移性乳腺癌的發生與發展。除了鑒定細胞系別，PCR技術還可以用于建立腫瘤模型。有研究表明，從不同細胞系中分離出的EpCAM(+)和HER2(+)亞群用于建立更接近原位的3D乳腺癌腫瘤模型，可以更準確地評估新的治療策略和藥物[22]。ZHAO等[23]通過PCR檢測發現CTC-3細胞上皮間質轉化和干性標志物的水平較MCF-7細胞更高，提示CTC-3細胞是研究乳腺癌惡性行為的更好模型。近年來，液滴/微孔PCR發展迅速，并可對多種遺傳信息如CRISPR/Cas9改進的KRAS突變、乳腺癌PIK3CA熱點突變進行快速、可靠、準確的定量檢測，該技術有廣闊的發展前景，未來有望逐步取代傳統的PCR。

基因測序目前應用最廣泛的是單細胞測序。XU等[24]對早期肺癌患者外周血中單個CTC進行外顯子DNA測序，檢測到包括細胞侵襲、DNA修復等相關基因的突變，有利于進一步探索腫瘤的異質性信息。單細胞測序還能通過拷貝數變異檢測存在異常的基因組，通過在數據庫中進行比對，從而在分子水平上分析單個細胞。

核酸分析法的關鍵在于檢測的基因與所研究疾病要有較強的關聯程度，與免疫熒光法相比，它可以提供客觀、可量化的結果，但需要裂解細胞，難以提供形態學方面的數據。

2.3光譜分析法 光譜分析技術廣泛應用于生物化學領域，如今也有用于鑒定CTC的報道，主要是微核磁共振檢測技術和拉曼檢測技術。

與磁場分離有異曲同工之處，微核磁共振檢測系統中包被抗體的磁納米顆粒與細胞結合后經磁響應而被分離，但后者產生的核磁共振信號起到了微小放大的作用，有效提高了檢測靈敏度,研究表明對大腸癌有較好的診斷價值[25]。拉曼檢測技術利用包被特異性抗體的活性納米探針與細胞結合，根據不同類型細胞特征譜線的差異鑒定CTC，這些納米探針由不同的拉曼報告分子(主要是有機化學物質)和納米顆粒構成，如CHO等[26]利用金納米顆粒構成的活性探針鑒定出了乳腺癌的5種亞型。拉曼檢測技術還可以無損傷地對細胞內部核酸進行分析，具有高靈敏度、高分辨率的特點，但目前主要用于檢測循環游離DNA和DNA損傷修復，相信未來在CTC鑒定方面有進一步的發展。

2.4蛋白質分析法 蛋白質分析法在基因翻譯水平通過檢測蛋白質水平來鑒定CTC，電泳技術、Northern雜交是常見的檢測手段，這里介紹的蛋白質芯片/微陣列即是基于以上技術原理而開發的。ProteinSimple公司研發的Milo是第一個可用于CTC鑒定的蛋白質芯片，由1 000～2 000個用于容納單細胞的微孔構成，細胞被裂解后電泳，并加入多種熒光抗體標記同時檢測數十種靶蛋白，與傳統檢測方法相比，可以進行單個細胞水平的鑒定分析。除此之外，通過檢測一系列代謝基因編碼的蛋白質，蛋白質分析法可以發現CTC高表達的基因，探索腫瘤與代謝基因的關系，并提示腫瘤的惡性變化。CHEN等[27]利用蛋白微陣列檢測前列腺癌患者的腫瘤細胞，確定磷酸甘油酸激酶(PGK1)和葡萄糖六磷酸脫氫酶(G6PD)可以作為CTC的最佳代謝標志物，且患者體內PGK1和G6PD水平與前列腺癌轉移程度呈正相關。但由于不同核酸的基因表達產物可能相似或一致，檢測靶蛋白前，需要確定涉及的相關基因的表達產物是否有交叉，否則無法得到真實可靠的結論。目前已經發展起來的CTC鑒定方法見表2。

表2 CTC的鑒定方法

3 總結與展望

美國食品藥品管理局(FDA)將CTC正式批準為癌癥進展監測中新的生物標志物，它的分離、鑒定對于腫瘤早期診斷、病情監測十分重要，因此，發展了許多技術方法。物理分離方法無需抗體標記或染色，可以較好地保留細胞的完整性和生物學活性，有利于后續細胞培養；而免疫學分離方法可能造成細胞抗原的丟失、改變。這些分離富集的方法推動了腫瘤疾病中整個基因組的研究，因此，需要通過各種分子標記、核酸分析、光譜分析等方法對細胞分離、鑒定。目前，檢測CTC仍處于臨床前階段，限制其臨床應用的主要因素是缺乏可靠的臨界值，以及用于分離、鑒定CTC的工具尚未成熟，還需要進行大量的臨床試驗來提供有效的證據。未來，相信CTC的檢測平臺會向著分離、鑒定一體化、多種技術聯合應用的方向發展，并能夠以簡便快速、準確可靠、低成本、高通量的檢測優勢服務于臨床與科研。