血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值

何 麟，陳 忠，趙春勤，張浩春，鄧功建，董先成

達(dá)州市中心醫(yī)院：1.腦血管病及介入治療科；2.泌尿外科，四川達(dá)州 635000

缺血性卒中的特點是高發(fā)病率和高病死率[1]。80%的缺血性卒中是由動脈粥樣硬化造成的動脈閉塞或狹窄引起的[2]。動脈粥樣硬化是由高脂血癥伴隨的血管壁慢性炎癥所致，這種炎癥由多種細(xì)胞類型引發(fā)，如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[3]。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可通過識別位于mRNA靶標(biāo)3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的結(jié)合位點來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)功能[4-5]。血清中的miRNA常作為各種疾病的潛在生物標(biāo)志物，如大腸癌、心肌梗死和急性粒細(xì)胞性白血病[6]。已有研究顯示，腦動脈粥樣硬化患者血清miR-33a、miR-29c、miR-126的表達(dá)失調(diào)[7-9]。本研究主要探討血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年1月在本院收治的腦動脈粥樣硬化患者120例為研究組，其中男54例，女66例，平均年齡(61.4±11.3)歲。腦動脈粥樣硬化是指腦動脈狹窄明顯(≥50%)，所有患者均接受CT和(或)核磁共振、腦多普勒超聲、腦部超聲、腦部磁共振腦血管成像、CT血管造影或數(shù)字減影血管造影、心臟超聲檢查或其他檢查，以識別腦血管疾病和心臟病。排除患有確定或不確定病因、嚴(yán)重心臟病、近期心肌梗死或心絞痛疾病、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重腎病或肝病、血栓性疾病或患有心臟栓塞性卒中的患者。根據(jù)動脈粥樣硬化(≥50%)時閉塞的動脈數(shù)量確定腦動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度，并將研究組分為單動脈組(23例)、雙動脈組(53例)和多動脈組(44例)。另選擇同期體檢健康者120例為對照組，其中男60例，女60例，平均年齡(60.5±14.2)歲。研究組和對照組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得所有參與者的知情同意。

1.2RNA提取與實時熒光定量PCR(qPCR) 2組受試者清晨抽取靜脈血3 mL。將標(biāo)本儲存在未裝有任何抗凝劑的試管中，4 ℃靜置過夜，之后在室溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液即為血清。將血清小心地轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，并保存至-80 ℃直至進一步處理。使用Trizol LS試劑從400 μL血清中提取總RNA (Takara，中國大連)。使用PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒(Takara,日本) 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR采用RotorGENE-3000和RotorGene6 qPCR檢測系統(tǒng)(Corbett Research America)一步法進行3個重復(fù)。所有miRNA引物均購自大連Takara公司。miRNA表達(dá)正常化為小核仁RNA U6。

2 結(jié) 果

2.1研究組與對照組血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達(dá)水平比較 血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達(dá)水平在研究組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對照組血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達(dá)水平比較

2.2血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項或聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-33a單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.95±0.02(95%CI=0.918 6～0.981 9)，當(dāng)miR-33a的陽性臨界值為0.882 6，其診斷靈敏度為95.00%，特異度為95.00%。miR-29c單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.93±0.02(95%CI=0.887 8～0.965 0)，當(dāng)miR-29c的陽性臨界值為1.143 0，其診斷靈敏度為93.00%，特異度為92.00%。miR-126單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.91±0.02(95%CI=0.871 6～0.955 3)，當(dāng)miR-126的陽性臨界值為1.406 0，其診斷靈敏度為92.00%，特異度為91.00%。

將患有腦動脈粥樣硬化的定義為真陽性，未患有腦動脈粥樣硬化的為真陰性。以miR-33a的陽性臨界值0.882 6、miR-29c的陽性臨界值1.143 0、miR-126的陽性臨界值1.406 0為診斷界限，三者滿足其一者為聯(lián)合診斷陽性。血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的靈敏度為96.67%，特異度為90.00%，準(zhǔn)確度為93.33%。見表2。

2.3血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度患者中的相對表達(dá)水平 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度患者中的相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且單動脈組患者的相對表達(dá)水平均低于雙動脈組，雙動脈組患者的表達(dá)水平均低于多動脈組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷四格表(n)

表3 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度患者中的相對表達(dá)水平

3 討 論

腦動脈粥樣硬化是缺血性卒中的最重要機制[10]。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)評估腦動脈粥樣硬化的特異性血清生物標(biāo)志物[11-12]。在本研究中，血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項檢測診斷腦動脈粥樣硬化的靈敏度分別為95.00%、93.00%、92.00%，特異度分別為95.00%、92.00%、91.00%。miRNA以高度穩(wěn)定的形式存在于循環(huán)系統(tǒng)中,它們對核糖核酸酶、凍融循環(huán)和其他劇烈的實驗條件具有抵抗力[13-14]。血清樣品可以在-20 ℃或-80 ℃的溫度下保存數(shù)月，而不會顯著降解miRNA[15]。因此，miRNA被認(rèn)為是理想的候選生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯(lián)合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷靈敏度為96.67%，特異度為90.00%，準(zhǔn)確度為93.33%，顯示了較好的診斷效能。

本研究結(jié)果顯示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達(dá)水平在研究組和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度患者中的相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明血清miRNA是由于發(fā)生缺血性卒中后，從受損或循環(huán)的腦細(xì)胞釋放而增加的，這與MAYR等[16]的早期研究結(jié)果一致。炎癥和免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[17]，miR-126的上調(diào)抑制了血管細(xì)胞黏附分子-1和腫瘤壞死因子α的表達(dá)，限制了白細(xì)胞對內(nèi)皮的黏附，減少了與動脈粥樣硬化過程有關(guān)的炎性反應(yīng)[18]。以往研究表明，miR-29c通過調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白A和3A)的miRNA靶標(biāo)來調(diào)節(jié)腦動脈粥樣硬化[19]。由miR-33a和miR-33b組成的miR-33家族是miRNA介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝調(diào)控最典型的miRNA之一，而脂質(zhì)代謝異常是動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)[20]。巨噬細(xì)胞特異性miR-33的丟失減少了高脂血癥條件下的脂質(zhì)蓄積和炎癥，從而減少斑塊負(fù)擔(dān)，緩解動脈粥樣硬化[5]。抗miR-33治療是降低動脈粥樣硬化的潛在治療手段。但是，研究組血清miR-33a、miR-29c、miR-126相對表達(dá)水平升高的原因尚不清楚。血清中的miRNA可能主要是由病變細(xì)胞釋放的，因此，在細(xì)胞受傷或變性時會增加，這間接表明miR-33a、miR-29c、miR-126在腦血管系統(tǒng)正常發(fā)育中起重要作用。

綜上所述，血清miR-33a、miR-29c、miR-126可作為聯(lián)合診斷腦動脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物。