2種進(jìn)口糖化清蛋白試劑的檢測(cè)性能評(píng)價(jià)*

董 磊，馬紅雨，全首禎，梁 佩，鞏 蓓，張 謹(jǐn)，馬越云，李偌銥

空軍特色醫(yī)學(xué)中心臨床檢驗(yàn)科，北京 100142

糖化清蛋白是血液中清蛋白與葡萄糖通過(guò)非酶促糖基化反應(yīng)形成的產(chǎn)物，可反映患者檢測(cè)前2～3周的平均血糖水平，我國(guó)實(shí)驗(yàn)室通常采用的正常參考值范圍為11%～17%[1-2]。

最早的糖化清蛋白測(cè)定為日本學(xué)者研發(fā)的高壓液相離子交換法(HPLC法)，但該方法處理樣本量小，費(fèi)用高昂，不適宜臨床常規(guī)開(kāi)展。2002年美國(guó)研制出固體酶法，特異度較高，但對(duì)于輸注高能量氨基酸的患者，測(cè)定結(jié)果會(huì)異常升高。近年來(lái)日本開(kāi)發(fā)研制的應(yīng)用液態(tài)酶法檢測(cè)糖化清蛋白(糖化清蛋白-L)具有良好的稀釋直線(xiàn)性、日內(nèi)重復(fù)性和日間穩(wěn)定性，并與HPLC法具有良好的一致性，因此，臨床上應(yīng)用最多[3]。2003年起，國(guó)內(nèi)陸續(xù)開(kāi)展液態(tài)酶法測(cè)定糖化清蛋白并應(yīng)用于臨床，但在結(jié)果的一致性上仍面臨較大挑戰(zhàn)。日本旭化成制藥株式會(huì)社(以下簡(jiǎn)稱(chēng)A)糖化清蛋白試劑出現(xiàn)最早，在國(guó)際市場(chǎng)占有率也最高[4]，并從2011年開(kāi)始參加上海市臨床檢驗(yàn)中心開(kāi)展的糖化清蛋白項(xiàng)目室間質(zhì)評(píng)工作，通過(guò)2019年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心和北京市臨床檢驗(yàn)中心的項(xiàng)目調(diào)查。日本積水醫(yī)療株式會(huì)社(以下簡(jiǎn)稱(chēng)B)生產(chǎn)的糖化清蛋白試劑于2018年取得我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局許可，上市時(shí)間較短，該試劑的臨床應(yīng)用缺少數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選取A試劑作為對(duì)照系統(tǒng)，評(píng)價(jià)B試劑的主要分析性能，并對(duì)2種進(jìn)口糖化清蛋白試劑進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑 試劑為A廠(chǎng)家和B廠(chǎng)家糖化清蛋白試劑盒及各自配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。儀器為日立7600全自動(dòng)生化分析儀。

1.1.2精密度實(shí)驗(yàn)樣本制備 選取糖尿病患者剩余血清，制備成高值混合血清H，選取體檢健康人群剩余血清制備成低值混合血清L，用于精密度實(shí)驗(yàn)。

1.1.3正確度驗(yàn)證樣本制備 選取北京市臨床檢驗(yàn)中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評(píng)樣本(轉(zhuǎn)換值202011：13.6%；202012：36.7%；202013：23.2%)，用于正確度驗(yàn)證。

1.1.4干擾實(shí)驗(yàn)樣本制備 選取實(shí)驗(yàn)室自配20倍干擾物(膽紅素F 300 mg/dL；血紅蛋白4 000 mg/dL；乳糜濁度200 mg/dL)，預(yù)混氨基酸葡萄糖注射液，以及體檢健康者剩余血清制備成血清S用于干擾實(shí)驗(yàn)。

1.1.5線(xiàn)性驗(yàn)證樣本制備 A試劑使用A廠(chǎng)家提供的接近線(xiàn)性水平上限的高值混合血清HH(糖化清蛋白水平為3.00 g/L，清蛋白水平為8.40 g/L)和接近線(xiàn)性水平下限的低值混合血清LL(糖化清蛋白水平為0.05 g/L，清蛋白水平為0.49 g/L)，按一定體積比配制成不同水平梯度的樣品，用于評(píng)價(jià)A試劑的線(xiàn)性范圍。B試劑按照廠(chǎng)家建議，使用去離子水W及B廠(chǎng)家提供的高值樣本HHH(糖化清蛋白水平為395.71 μmol/L，清蛋白水平為666.62 μmol/L)按一定體積比配制成不同水平梯度的樣本，用于評(píng)價(jià)B試劑的線(xiàn)性范圍。

1.2方法

1.2.1精密度 參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(NCCLS) EP15-A文件[5]，使用2種試劑分別測(cè)定高低值混合血清H和L，連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定3次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)及總CV，以<1/4北京市臨床檢驗(yàn)中心允許偏差(<3.75%)為基本要求。

1.2.2正確度 使用2種試劑分別測(cè)定北京市臨床檢驗(yàn)中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評(píng)樣本，計(jì)算測(cè)定值與認(rèn)證值的平均百分偏倚，以<1/2允許總誤差(±7.50%)為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3干擾實(shí)驗(yàn) 參考NCCLS EP07-P文件[6]進(jìn)行部分調(diào)整后配制干擾物，將干擾物加入到體檢健康混合血清S中，制成含特定水平干擾物的干擾血清，干擾血清的膽紅素F終水平為15 mg/dL；血紅蛋白終水平為200 mg/dL；乳糜濁度終水平為10 mg/dL。采用2種試劑分別測(cè)定干擾血清各3次，求均值，計(jì)算添加干擾物后與干擾物為0時(shí)的百分偏差(Bias%)。向體檢健康者混合血清S(糖化清蛋白13%～15%)中加入預(yù)混氨基酸葡萄糖注射液，模擬氨基酸葡萄糖輸液患者體內(nèi)糖化氨基酸的情況，比較2種試劑去除內(nèi)源性氨基酸干擾的能力，以相對(duì)偏差±10.00%為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4線(xiàn)性試驗(yàn) 因糖化清蛋白為計(jì)算項(xiàng)目，但實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量管理和排查疑問(wèn)時(shí)需要分開(kāi)考慮來(lái)自糖化清蛋白水平檢測(cè)和清蛋白水平檢測(cè)兩方面的因素，故將糖化清蛋白水平和清蛋白水平分別進(jìn)行線(xiàn)性驗(yàn)證。將高值混合血清HH和低值混合血清LL按1LL、1HH∶4LL、2HH∶3LL、3HH∶2LL、4HH∶1LL、1HH配制成6個(gè)水平梯度的樣本，以進(jìn)行A試劑的線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。將高值樣本HHH和去離子水W按1W、1HHH∶4W、2HHH∶3W、3HHH∶2W、4HHH∶1W、1HHH配制成6個(gè)水平梯度的樣本，以進(jìn)行B試劑的線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。2種試劑分別對(duì)各自水平梯度樣本按低水平到高水平的順序各測(cè)定2次，記錄測(cè)定結(jié)果。按照NCCLS EP06-A文件[7]提供的方案檢查數(shù)據(jù)，檢查離群值，判斷重復(fù)性，之后進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸，將結(jié)果分別擬合方程，并繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行評(píng)價(jià)。若所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)呈明顯直線(xiàn)趨勢(shì)，用直線(xiàn)回歸對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得直線(xiàn)回歸方程Y=aX+b，若決定系數(shù)(R2)>0.996 0，斜率(a)為0.97～1.03，則判定為線(xiàn)性。

1.2.5特殊樣本實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室當(dāng)日血清清蛋白水平低于3.50 g/L的剩余血清10份，用于評(píng)價(jià)2種試劑對(duì)于低清蛋白樣本的檢測(cè)能力。

1.2.6比對(duì)實(shí)驗(yàn) 用覆蓋檢測(cè)范圍的20份不同水平人血清樣本，進(jìn)行2種試劑的比對(duì)試驗(yàn)。2種試劑分別對(duì)20份樣本進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本檢測(cè)1遍，用線(xiàn)性回歸方法對(duì)兩組結(jié)果分別進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到線(xiàn)性回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)和a。

2 結(jié) 果

2.1精密度結(jié)果 2種試劑的精密度均滿(mǎn)足臨床應(yīng)用要求。見(jiàn)表1。

表1 2種試劑的精密度結(jié)果

2.2正確度結(jié)果 2種試劑在檢測(cè)北京市臨床檢驗(yàn)中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評(píng)樣本時(shí)均符合要求。見(jiàn)表2。

表2 2種試劑的正確度結(jié)果

2.3干擾試驗(yàn)結(jié)果 15 mg/dL膽紅素F、10 mg/dL乳糜對(duì)A、B試劑的影響均在可接受范圍內(nèi)。200 mg/dL血紅蛋白對(duì)A試劑有略微負(fù)影響，對(duì)B試劑有明顯正影響(20.50%)，超過(guò)可接受范圍。糖化氨基酸對(duì)A試劑有略微正影響，對(duì)B試劑的影響超過(guò)可接受范圍。見(jiàn)表3。

2.4線(xiàn)性驗(yàn)證 A試劑的預(yù)期值與實(shí)測(cè)值散點(diǎn)圖如圖1所示，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，A試劑糖化清蛋白和清蛋白組分的R2分別為0.999 0、0.999 2，均在0.998 0～1.000 0范圍內(nèi)，a分別為0.994 0、1.020 5，均在0.970 0～1.030 0。B試劑糖化清蛋白和清蛋白組分的預(yù)期值與實(shí)測(cè)值散點(diǎn)圖如圖2所示，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，B試劑糖化清蛋白組分的R2為0.991 8，a為0.950 7，且有3個(gè)水平值超過(guò)允許偏倚，不符合a在0.970 0～1.030 0的技術(shù)要求范圍； B試劑清蛋白組分的R2為0.998 7，a為0.986 5，在可接受范圍內(nèi)。

表3 各干擾物對(duì)2種試劑檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差(%)

2.5特殊樣本試驗(yàn) 用2種試劑檢測(cè)低蛋白血癥患者樣本結(jié)果見(jiàn)表4。2種試劑檢測(cè)結(jié)果r為0.805 2，但檢測(cè)結(jié)果間存在顯著差異(t=-3.12，P<0.05)，除2個(gè)樣本外，B試劑檢測(cè)結(jié)果均高于A試劑。

注：A表示糖化清蛋白，B表示清蛋白。

注：A表示糖化清蛋白，B表示清蛋白。

表4 2種試劑對(duì)低蛋白血癥患者樣本的檢測(cè)結(jié)果

2.6比對(duì)試驗(yàn) 以A試劑作為對(duì)照系統(tǒng)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示2種試劑間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較高(r=0.987 6)，但檢測(cè)結(jié)果間存在顯著性差異(t=-5.67，P<0.01)；除3個(gè)樣本外，B試劑檢測(cè)結(jié)果均高于A試劑，占總檢測(cè)量20例的85%，其中結(jié)果相對(duì)偏差超過(guò)7.50%的有6例，占30%，相對(duì)偏差超過(guò)10.00%的有1例，占5%。

表5 2種試劑比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表5 2種試劑比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

2020年我國(guó)最新糖尿病流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，我國(guó)成人糖尿病患病率為12.8%，估計(jì)糖尿病患者總數(shù)為1.298億，糖尿病前期患病率為35.2%，糖尿病患者的知情率僅為43.3%[8]。而2008年流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，20歲以上人群，年齡標(biāo)準(zhǔn)化的糖尿病患病率為9.7%[9]；2010年流行病學(xué)調(diào)查顯示，18歲及以上成人糖尿病患病率為11.6%[10]。糖尿病患者數(shù)逐漸增加，這意味著我國(guó)糖尿病預(yù)防工作不容樂(lè)觀。我國(guó)糖尿病患者以餐后高血糖為主，男性糖尿病前期患者的空腹血糖受損、糖耐量受損、空腹血糖受損合并糖耐量受損分別為19.9%、68.3%、11.8%，女性糖尿病前期患者為14.9%、73.6%、11.5%，僅用空腹血糖篩查可能造成較高的漏診率[11]。而由于經(jīng)濟(jì)差異和操作的可行性，我國(guó)目前糖尿病的初篩通常還是以空腹血糖為主，這也可能是造成我國(guó)糖尿病患者知情率較低的原因之一。有研究指出，空腹血糖聯(lián)合糖化清蛋白篩查糖尿病，可將篩查靈敏度和特異度均提高到92%以上，有效提高篩查效率，減少漏診率[12]。

隨機(jī)血糖檢測(cè)易受飲食、藥物、情緒等因素影響，無(wú)法體現(xiàn)一段時(shí)間內(nèi)的血糖控制情況。糖化血紅蛋白通常被認(rèn)為是臨床監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期血糖控制的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它可以反映檢測(cè)前2～3個(gè)月的平均血糖水平，但是很難反映餐后血漿葡萄糖水平或血糖的波動(dòng)。除此之外，任何改變紅細(xì)胞壽命的因素都將導(dǎo)致糖化血紅蛋白結(jié)果不準(zhǔn)確，如溶血性貧血等。糖化清蛋白是臨床上血糖監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一，能反映近期血糖情況，適用于血糖波動(dòng)較大的新發(fā)糖尿病患者治療效果評(píng)價(jià)，且糖化清蛋白與糖尿病血管并發(fā)癥相關(guān)，可預(yù)測(cè)心血管事件的發(fā)生，具有較高的臨床價(jià)值[13]。隨著糖化清蛋白在臨床中應(yīng)用價(jià)值逐漸提高，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可比性成為其在臨床中應(yīng)用的關(guān)鍵因素[14]。

已有國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)多家國(guó)產(chǎn)糖化清蛋白試劑和A試劑做過(guò)性能比較[15]，本研究則主要針對(duì)2種進(jìn)口試劑進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)。本研究結(jié)果顯示，2種試劑的精密度和正確度均可滿(mǎn)足臨床使用要求。A試劑的線(xiàn)性和抗干擾能力更優(yōu)；血紅蛋白和糖化氨基酸對(duì)B試劑具有顯著影響。2種進(jìn)口試劑均采用對(duì)清蛋白特異度更高的溴甲酚紫方法以提高清蛋白的檢測(cè)能力，但在B試劑的說(shuō)明書(shū)中仍然提示，測(cè)定低清蛋白血癥患者，有可能得不到正確的糖化清蛋白(%)。

本研究驗(yàn)證糖化清蛋白試劑對(duì)于低蛋白血癥患者的檢測(cè)能力，2種試劑間存在較大差異，為進(jìn)一步提升臨床服務(wù)能力，推動(dòng)臨床應(yīng)用發(fā)展，糖化清蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化及各廠(chǎng)家試劑檢測(cè)結(jié)果一致化問(wèn)題應(yīng)引起重視。