2種進口糖化清蛋白試劑的檢測性能評價*

董 磊，馬紅雨，全首禎，梁 佩，鞏 蓓，張 謹，馬越云，李偌銥

空軍特色醫(yī)學中心臨床檢驗科，北京 100142

糖化清蛋白是血液中清蛋白與葡萄糖通過非酶促糖基化反應形成的產(chǎn)物，可反映患者檢測前2～3周的平均血糖水平，我國實驗室通常采用的正常參考值范圍為11%～17%[1-2]。

最早的糖化清蛋白測定為日本學者研發(fā)的高壓液相離子交換法(HPLC法)，但該方法處理樣本量小，費用高昂，不適宜臨床常規(guī)開展。2002年美國研制出固體酶法，特異度較高，但對于輸注高能量氨基酸的患者，測定結(jié)果會異常升高。近年來日本開發(fā)研制的應用液態(tài)酶法檢測糖化清蛋白(糖化清蛋白-L)具有良好的稀釋直線性、日內(nèi)重復性和日間穩(wěn)定性，并與HPLC法具有良好的一致性，因此，臨床上應用最多[3]。2003年起，國內(nèi)陸續(xù)開展液態(tài)酶法測定糖化清蛋白并應用于臨床，但在結(jié)果的一致性上仍面臨較大挑戰(zhàn)。日本旭化成制藥株式會社(以下簡稱A)糖化清蛋白試劑出現(xiàn)最早，在國際市場占有率也最高[4]，并從2011年開始參加上海市臨床檢驗中心開展的糖化清蛋白項目室間質(zhì)評工作，通過2019年國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心和北京市臨床檢驗中心的項目調(diào)查。日本積水醫(yī)療株式會社(以下簡稱B)生產(chǎn)的糖化清蛋白試劑于2018年取得我國國家藥品監(jiān)督管理局許可，上市時間較短，該試劑的臨床應用缺少數(shù)據(jù)和文獻報道。本研究選取A試劑作為對照系統(tǒng)，評價B試劑的主要分析性能，并對2種進口糖化清蛋白試劑進行方法學比對。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑 試劑為A廠家和B廠家糖化清蛋白試劑盒及各自配套校準品和質(zhì)控品。儀器為日立7600全自動生化分析儀。

1.1.2精密度實驗樣本制備 選取糖尿病患者剩余血清，制備成高值混合血清H，選取體檢健康人群剩余血清制備成低值混合血清L，用于精密度實驗。

1.1.3正確度驗證樣本制備 選取北京市臨床檢驗中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評樣本(轉(zhuǎn)換值202011：13.6%；202012：36.7%；202013：23.2%)，用于正確度驗證。

1.1.4干擾實驗樣本制備 選取實驗室自配20倍干擾物(膽紅素F 300 mg/dL；血紅蛋白4 000 mg/dL；乳糜濁度200 mg/dL)，預混氨基酸葡萄糖注射液，以及體檢健康者剩余血清制備成血清S用于干擾實驗。

1.1.5線性驗證樣本制備 A試劑使用A廠家提供的接近線性水平上限的高值混合血清HH(糖化清蛋白水平為3.00 g/L，清蛋白水平為8.40 g/L)和接近線性水平下限的低值混合血清LL(糖化清蛋白水平為0.05 g/L，清蛋白水平為0.49 g/L)，按一定體積比配制成不同水平梯度的樣品，用于評價A試劑的線性范圍。B試劑按照廠家建議，使用去離子水W及B廠家提供的高值樣本HHH(糖化清蛋白水平為395.71 μmol/L，清蛋白水平為666.62 μmol/L)按一定體積比配制成不同水平梯度的樣本，用于評價B試劑的線性范圍。

1.2方法

1.2.1精密度 參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會(NCCLS) EP15-A文件[5]，使用2種試劑分別測定高低值混合血清H和L，連續(xù)測定5 d，每天測定3次，計算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)及總CV，以<1/4北京市臨床檢驗中心允許偏差(<3.75%)為基本要求。

1.2.2正確度 使用2種試劑分別測定北京市臨床檢驗中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評樣本，計算測定值與認證值的平均百分偏倚，以<1/2允許總誤差(±7.50%)為判斷標準。

1.2.3干擾實驗 參考NCCLS EP07-P文件[6]進行部分調(diào)整后配制干擾物，將干擾物加入到體檢健康混合血清S中，制成含特定水平干擾物的干擾血清，干擾血清的膽紅素F終水平為15 mg/dL；血紅蛋白終水平為200 mg/dL；乳糜濁度終水平為10 mg/dL。采用2種試劑分別測定干擾血清各3次，求均值，計算添加干擾物后與干擾物為0時的百分偏差(Bias%)。向體檢健康者混合血清S(糖化清蛋白13%～15%)中加入預混氨基酸葡萄糖注射液，模擬氨基酸葡萄糖輸液患者體內(nèi)糖化氨基酸的情況，比較2種試劑去除內(nèi)源性氨基酸干擾的能力，以相對偏差±10.00%為判斷標準。

1.2.4線性試驗 因糖化清蛋白為計算項目，但實驗室內(nèi)進行質(zhì)量管理和排查疑問時需要分開考慮來自糖化清蛋白水平檢測和清蛋白水平檢測兩方面的因素，故將糖化清蛋白水平和清蛋白水平分別進行線性驗證。將高值混合血清HH和低值混合血清LL按1LL、1HH∶4LL、2HH∶3LL、3HH∶2LL、4HH∶1LL、1HH配制成6個水平梯度的樣本，以進行A試劑的線性實驗。將高值樣本HHH和去離子水W按1W、1HHH∶4W、2HHH∶3W、3HHH∶2W、4HHH∶1W、1HHH配制成6個水平梯度的樣本，以進行B試劑的線性實驗。2種試劑分別對各自水平梯度樣本按低水平到高水平的順序各測定2次，記錄測定結(jié)果。按照NCCLS EP06-A文件[7]提供的方案檢查數(shù)據(jù)，檢查離群值，判斷重復性，之后進行多元線性回歸，將結(jié)果分別擬合方程，并繪制散點圖進行評價。若所有實驗點呈明顯直線趨勢，用直線回歸對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，得直線回歸方程Y=aX+b，若決定系數(shù)(R2)>0.996 0，斜率(a)為0.97～1.03，則判定為線性。

1.2.5特殊樣本實驗 隨機選取實驗室當日血清清蛋白水平低于3.50 g/L的剩余血清10份，用于評價2種試劑對于低清蛋白樣本的檢測能力。

1.2.6比對實驗 用覆蓋檢測范圍的20份不同水平人血清樣本，進行2種試劑的比對試驗。2種試劑分別對20份樣本進行檢測，每份樣本檢測1遍，用線性回歸方法對兩組結(jié)果分別進行線性擬合，得到線性回歸方程相關系數(shù)(r)和a。

2 結(jié) 果

2.1精密度結(jié)果 2種試劑的精密度均滿足臨床應用要求。見表1。

表1 2種試劑的精密度結(jié)果

2.2正確度結(jié)果 2種試劑在檢測北京市臨床檢驗中心2020年第1次糖化清蛋白室間質(zhì)評樣本時均符合要求。見表2。

表2 2種試劑的正確度結(jié)果

2.3干擾試驗結(jié)果 15 mg/dL膽紅素F、10 mg/dL乳糜對A、B試劑的影響均在可接受范圍內(nèi)。200 mg/dL血紅蛋白對A試劑有略微負影響，對B試劑有明顯正影響(20.50%)，超過可接受范圍。糖化氨基酸對A試劑有略微正影響，對B試劑的影響超過可接受范圍。見表3。

2.4線性驗證 A試劑的預期值與實測值散點圖如圖1所示，在試驗水平范圍內(nèi)，A試劑糖化清蛋白和清蛋白組分的R2分別為0.999 0、0.999 2，均在0.998 0～1.000 0范圍內(nèi)，a分別為0.994 0、1.020 5，均在0.970 0～1.030 0。B試劑糖化清蛋白和清蛋白組分的預期值與實測值散點圖如圖2所示，在試驗水平范圍內(nèi)，B試劑糖化清蛋白組分的R2為0.991 8，a為0.950 7，且有3個水平值超過允許偏倚，不符合a在0.970 0～1.030 0的技術要求范圍； B試劑清蛋白組分的R2為0.998 7，a為0.986 5，在可接受范圍內(nèi)。

表3 各干擾物對2種試劑檢測結(jié)果的相對偏差(%)

2.5特殊樣本試驗 用2種試劑檢測低蛋白血癥患者樣本結(jié)果見表4。2種試劑檢測結(jié)果r為0.805 2，但檢測結(jié)果間存在顯著差異(t=-3.12，P<0.05)，除2個樣本外，B試劑檢測結(jié)果均高于A試劑。

注：A表示糖化清蛋白，B表示清蛋白。

注：A表示糖化清蛋白，B表示清蛋白。

表4 2種試劑對低蛋白血癥患者樣本的檢測結(jié)果

2.6比對試驗 以A試劑作為對照系統(tǒng)，比對結(jié)果見表5。結(jié)果顯示2種試劑間檢測結(jié)果相關性較高(r=0.987 6)，但檢測結(jié)果間存在顯著性差異(t=-5.67，P<0.01)；除3個樣本外，B試劑檢測結(jié)果均高于A試劑，占總檢測量20例的85%，其中結(jié)果相對偏差超過7.50%的有6例，占30%，相對偏差超過10.00%的有1例，占5%。

表5 2種試劑比對實驗結(jié)果

續(xù)表5 2種試劑比對實驗結(jié)果

3 討 論

2020年我國最新糖尿病流行病學調(diào)查研究顯示，我國成人糖尿病患病率為12.8%，估計糖尿病患者總數(shù)為1.298億，糖尿病前期患病率為35.2%，糖尿病患者的知情率僅為43.3%[8]。而2008年流行病學調(diào)查報告顯示，20歲以上人群，年齡標準化的糖尿病患病率為9.7%[9]；2010年流行病學調(diào)查顯示，18歲及以上成人糖尿病患病率為11.6%[10]。糖尿病患者數(shù)逐漸增加，這意味著我國糖尿病預防工作不容樂觀。我國糖尿病患者以餐后高血糖為主，男性糖尿病前期患者的空腹血糖受損、糖耐量受損、空腹血糖受損合并糖耐量受損分別為19.9%、68.3%、11.8%，女性糖尿病前期患者為14.9%、73.6%、11.5%，僅用空腹血糖篩查可能造成較高的漏診率[11]。而由于經(jīng)濟差異和操作的可行性，我國目前糖尿病的初篩通常還是以空腹血糖為主，這也可能是造成我國糖尿病患者知情率較低的原因之一。有研究指出，空腹血糖聯(lián)合糖化清蛋白篩查糖尿病，可將篩查靈敏度和特異度均提高到92%以上，有效提高篩查效率，減少漏診率[12]。

隨機血糖檢測易受飲食、藥物、情緒等因素影響，無法體現(xiàn)一段時間內(nèi)的血糖控制情況。糖化血紅蛋白通常被認為是臨床監(jiān)測長期血糖控制的“金標準”，它可以反映檢測前2～3個月的平均血糖水平，但是很難反映餐后血漿葡萄糖水平或血糖的波動。除此之外，任何改變紅細胞壽命的因素都將導致糖化血紅蛋白結(jié)果不準確，如溶血性貧血等。糖化清蛋白是臨床上血糖監(jiān)測的重要指標之一，能反映近期血糖情況，適用于血糖波動較大的新發(fā)糖尿病患者治療效果評價，且糖化清蛋白與糖尿病血管并發(fā)癥相關，可預測心血管事件的發(fā)生，具有較高的臨床價值[13]。隨著糖化清蛋白在臨床中應用價值逐漸提高，檢測結(jié)果的準確可比性成為其在臨床中應用的關鍵因素[14]。

已有國內(nèi)學者對多家國產(chǎn)糖化清蛋白試劑和A試劑做過性能比較[15]，本研究則主要針對2種進口試劑進行驗證評價。本研究結(jié)果顯示，2種試劑的精密度和正確度均可滿足臨床使用要求。A試劑的線性和抗干擾能力更優(yōu)；血紅蛋白和糖化氨基酸對B試劑具有顯著影響。2種進口試劑均采用對清蛋白特異度更高的溴甲酚紫方法以提高清蛋白的檢測能力，但在B試劑的說明書中仍然提示，測定低清蛋白血癥患者，有可能得不到正確的糖化清蛋白(%)。

本研究驗證糖化清蛋白試劑對于低蛋白血癥患者的檢測能力，2種試劑間存在較大差異，為進一步提升臨床服務能力，推動臨床應用發(fā)展，糖化清蛋白檢測標準化及各廠家試劑檢測結(jié)果一致化問題應引起重視。