lncRNA HCG11-201對腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響*

楊 超，譚 威，崔應(yīng)東，向 奎，廖兆琳

恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院泌尿外科，湖北恩施 445000

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，其發(fā)病率在我國呈逐年增加的趨勢[1]。腎癌的主要治療手段是外科手術(shù)，對放療和化療均不敏感[2]。腎癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其分子機(jī)制研究對治療方案的篩選和預(yù)后判斷具有非常重要的臨床價(jià)值。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類超過200核苷酸的非編碼小分子RNA，可在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)水平進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控[3]。lncRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖、發(fā)育、凋亡、分化、驗(yàn)證等細(xì)胞活動(dòng)，在細(xì)胞生理和病理過程中起關(guān)鍵作用[4]。有研究表明，lncRNA在多種惡性腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、宮頸癌等中表達(dá)異常，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]。HCG11-201是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中均扮演“抑癌基因”的作用[6-7]。本研究旨在探討HCG11-201在腎癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況及對腎癌患者預(yù)后的影響，并進(jìn)一步研究HCG11-201對腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 選取2017年3月至 2019年7月在恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院泌尿外科進(jìn)行腎癌手術(shù)切除的患者59例為研究對象，標(biāo)本來源于患者的腎癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)。患者平均年齡(63.21±13.86)歲；男37例，女22例；臨床分期：T1期24例，T2期21例，T3期14例。組織學(xué)分級：高、中分化腺癌27例，低分化腺癌32例。所有患者術(shù)前均未接受化療及放療，癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理確診為腎癌。本研究經(jīng)恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細(xì)胞與試劑 腎癌細(xì)胞(ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2)和人正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購自上海素爾生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；HCG11-201質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自上海艾博斯生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自寶生物(大連)公司；MTT購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；線粒體融合蛋白2(mitofusion-2)、p-AKT、p-mTORC2、p-IKK、p-MDM2和β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz(北京)公司；引物購自上海生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)腎小管上皮HK-2細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)腎癌細(xì)胞ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。取對數(shù)生長期的Caki-1細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%，根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HCG11-201質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測 提取組織和細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別采用HCG11-201、miR-522、mitofusion-2引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，檢測細(xì)胞中HCG11-201和mitofusion-2的表達(dá)，以U6為內(nèi)參檢測細(xì)胞中miR-522的表達(dá)。具體步驟嚴(yán)格參照說明書操作。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

1.2.3MTT法 轉(zhuǎn)染完成后24 h，消化收集每組細(xì)胞，將Caki-1細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第1、2、3、4、5天時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入20 μL MTT試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察顏色變化。4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min保證結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測量每孔在490 nm波長處的吸光度(A)值。以A值為縱軸，時(shí)間(d)為橫軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

表1 qPCR引物序列

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn) 采用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，在Transwell上室加入50 μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱內(nèi)凝固成形。Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染完成后24 h，消化收集每組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸后，分別接種到Transwell上室，每室5×104個(gè)細(xì)胞。24 h后棄去培養(yǎng)基，棉簽擦去未穿過膜的細(xì)胞。甲醇溶液固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色20 min。顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)。

1.2.5生物信息學(xué)方法預(yù)測 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫對腎癌中HCG11-201的表達(dá)進(jìn)行生存分析。采用靶基因預(yù)測軟件LncBase Predicted v.2預(yù)測HCG11-201可吸附結(jié)合的微小RNA(miRNA)。采用靶基因預(yù)測軟件MicroT-CDS預(yù)測miRNA的下游基因。

1.2.6Western blot 轉(zhuǎn)染完成后48 h，消化收集每組細(xì)胞，提取總蛋白。等量上樣至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴下90 V轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶在37 ℃封閉2 h。分別與一抗(mitofusion-2、p-AKT、p-mTORC2、p-IKK、p-MDM2和β-actin)在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，分別與二抗在室溫下孵育1 h。洗膜后，采用凝膠成像分析儀曝光、顯影。

2 結(jié) 果

2.1HCG11-201在腎癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) 癌旁正常組織和腎癌組織中 HCG11-201的相對表達(dá)水平分別為8.03±0.56和3.17±0.37，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2HCG11-201在腎癌患者中的生存分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，HCG11-201的相對表達(dá)水平越高，腎癌患者的生存時(shí)間越長(P<0.01)。

2.3HCG11-201在腎癌細(xì)胞和正常腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá) 腎癌細(xì)胞(ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2)和正常腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中 HCG11-201的相對表達(dá)水平分別為0.79±0.03、0.09±0.02、0.54±0.04、0.24±0.03、0.63±0.03和1.00±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中Caki-1細(xì)胞相對表達(dá)水平最低(P<0.01)。

2.4轉(zhuǎn)染后Caki-1細(xì)胞中HCG11-201的表達(dá) HCG11-201質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caki-1細(xì)胞后抽取lncRNA，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HCG11-201的相對表達(dá)水平顯著升高(1.03±0.15vs.10.56±0.86)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5HCG11-201對Caki-1細(xì)胞增殖活性的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HCG11-201后，從檢測第2天開始，Caki-1細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.6HCG11-201對Caki-1細(xì)胞侵襲能力的影響 Tranwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過Tranwell上室基底膜的Caki-1細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組(31.46±7.09vs.89.87±7.43)，細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：A表示對照組，B表示實(shí)驗(yàn)組。

2.7HCG11-201互補(bǔ)結(jié)合的miRNA及miRNA下游靶基因 靶基因預(yù)測軟件顯示，LncBase Predicted v.2預(yù)測HCG11-201互補(bǔ)結(jié)合的miRNA為miR-522，靶基因預(yù)測軟件MicroT-CDS預(yù)測miR-522的下游靶基因?yàn)閙itofusion-2。見圖3。

2.8轉(zhuǎn)染HCG11-201對miR-522和mitofusion-2 mRNA表達(dá)的影響 qPCR顯示，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Caki-1細(xì)胞中miR-522的相對表達(dá)水平顯著降低(1.01±0.08vs.0.19±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；mitofusion-2 mRNA的相對表達(dá)水平顯著升高(1.14±0.35vs.6.17±0.61)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.9轉(zhuǎn)染HCG11-201對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HCG11-201后，mitofusion-2蛋白水平升高，p-AKT、p-mTORC2、p-IKK和p-MDM2蛋白水平降低。見圖4。

圖3 HCG11-201與下游miRNA及下游靶基因的結(jié)合位點(diǎn)

圖4 上調(diào)HCG11-201表達(dá)后Caki-1細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot圖

3 討 論

腎癌的發(fā)生、發(fā)展與多種信號通路及基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的過程[8]。近年來隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，明確腎癌的發(fā)病機(jī)制和尋找基因靶向治療是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。越來越多的研究表明，lncRNA如ROR、NBAT1、AFAP1-AS1、HOTTIP等在腎癌組織和癌旁正常組織中存在差異表達(dá)，在腎癌細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[9-12]。HCG11-201是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，CHEN等[13]研究表明，HCG11-201在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，可通過充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA吸附miR-496，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。ZHANG等[7]研究表明，前列腺癌組織中HCG11-201的相對表達(dá)水平顯著低于非腫瘤組織，HCG11-201的相對表達(dá)水平與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、前列腺特異性抗原水平、Gleason評分和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，且前列腺癌組織中HCG11-201低表達(dá)與前列腺癌患者的生存不良有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HCG11-201在腎癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染上調(diào)Caki-1細(xì)胞中HCG11-201的表達(dá)，Caki-1細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力均受到顯著抑制，表明HCG11-201的異常低表達(dá)與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，HCG11-201的相對表達(dá)水平越高，腎癌患者的生存時(shí)間越長，HCG11-201與腎癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)，HCG11-201可能成為腎癌的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

研究表明，lncRNA可通過充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA吸附下游miRNA，間接抑制miRNA對下游靶基因的干擾作用[9,14]。靶基因預(yù)測軟件LncBase Predicted v.2預(yù)測HCG11-201的下游miRNA為miR-522。miR-522在骨肉瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，發(fā)揮顯著的“癌基因”作用[15-16]。上調(diào)HCG11-201的表達(dá)后，miR-522表達(dá)下調(diào)，表明HCG11-201可吸附miR-522，抑制miR-522的表達(dá)。靶基因預(yù)測軟件MicroT-CDS結(jié)果顯示，mitofusion-2可能是miR-522的靶基因。mitofusion-2蛋白是一種高度保守的跨膜三磷鳥苷酶，位于線粒體外膜中，是促進(jìn)線粒體融合的重要成分，在維持線粒體和細(xì)胞功能方面具有重要作用[17]。mitofusion-2蛋白在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，其過表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[18]。本研究中miR-522表達(dá)被抑制后，mitofusion-2基因表達(dá)顯著增加。mitofusion-2蛋白主要通過抑制AKT/mTOR信號通路的活化，發(fā)揮腫瘤抑制作用[19]。本研究中mitofusion-2蛋白水平升高后，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、p-mTORC2、p-MDM2和p-IKK蛋白水平均顯著降低，提示AKT/mTOR信號通路被抑制。

綜上所述，HCG11-201在腎癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，HCG11-201的相對表達(dá)水平與腎癌患者的生存期具有相關(guān)性。上調(diào)腎癌細(xì)胞Caki-1中HCG11-201的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其分子機(jī)制可能為HCG11-201充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA吸附miR-522，進(jìn)而促進(jìn)mitofusion-2蛋白的表達(dá)。