黃連中藥根堿分別聯(lián)合阿米卡星與頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑菌作用*

李 瑩，施 瑜，段秀杰，周銀霞

1.鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212031；3.鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥械科，江蘇鎮(zhèn)江 212001

近年來(lái)，因廣譜抗菌藥物的大量使用，耐多藥的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株不斷出現(xiàn)，且有在全球范圍內(nèi)流行的趨勢(shì)，廣泛耐藥株的檢出率也逐漸升高[1-2]。臨床醫(yī)生越來(lái)越多地依賴碳青霉烯類藥物針對(duì)耐藥革蘭陰性桿菌引起的感染進(jìn)行靶向治療，但耐藥革蘭陰性桿菌對(duì)碳青霉烯的耐藥率正在增加，特別是克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌[3-5]。目前，泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)肺炎的主要病原體之一，可導(dǎo)致菌血癥和敗血癥等并發(fā)癥[6]。能治療泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的抗菌藥物數(shù)量有限，僅包括多黏菌素和替加環(huán)素。然而，多黏菌素的功效受腎毒性和耐黏菌素的菌株限制，此外，替加環(huán)素的臨床療效仍存在爭(zhēng)議。因此，臨床上對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染常采用兩藥、三藥聯(lián)合治療[7-8]。黃連中藥根堿為中藥制劑，具有辛涼解表、清熱解毒、抗菌等作用，而阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦均為臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌常用抗菌藥物[9-10]。本研究擬探討黃連中藥根堿分別聯(lián)合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦2種不同抗菌藥物的抑菌作用，為臨床合理用藥及中西藥聯(lián)合抑菌機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 標(biāo)本來(lái)自2018年9月至2019年9月鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院及江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院分離的25株鮑曼不動(dòng)桿菌，質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2儀器與試劑 M-H瓊脂培養(yǎng)基、M-H肉湯培養(yǎng)基、麥康凱選擇平板、血平板(上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為SH103567、SH113529、HK1005、HK1010)；微生物鑒定藥敏板(珠海迪爾生物工程有限公司，批號(hào)108839)；DL-96Ⅱ型半自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀、SCAN-10型自動(dòng)加樣儀、DL-ZD3型數(shù)字式濁度計(jì)(珠海迪爾生物工程有限公司)；HR40-ⅡA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；賽默飛3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛科技公司)；BSA224S-CW型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.1.3試驗(yàn)藥物 黃連中藥根堿(黃連提取物包括14.45%的鹽酸藥根堿和60.24%的鹽酸小檗堿。哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號(hào)20190716)；鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)0756-201504、110317-201208，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)；硫酸阿米卡星注射液(遼寧新高制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H21024269，規(guī)格2 mL∶0.2 g，批號(hào)20190811)；注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1,珠海金鴻藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066374，規(guī)格1 g，包括頭孢哌酮0.5 g與舒巴坦0.5 g，批號(hào)190527)。

1.2方法

1.2.1分離與鑒定

1.2.1.1分離培養(yǎng) 痰液標(biāo)本以平板劃線法接種于麥康凱選擇培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，35 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，鮑曼不動(dòng)桿菌的菌落光滑、邊緣整齊，呈灰白色、圓形，直徑2～3 mm。挑取鮑曼不動(dòng)桿菌可疑菌落，涂片進(jìn)行革蘭染色，并再次接種于血瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，35 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.1.2菌落鑒定 標(biāo)本分純培養(yǎng)后，采用DL-96Ⅱ型半自動(dòng)微生物鑒定儀和藥敏分析系統(tǒng)按照CLSIM100-S26原則進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，25株鮑曼不動(dòng)桿菌均為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，該菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、氨芐西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、美洛培南、亞胺培南、米諾環(huán)素、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑全部耐藥。

1.2.2試驗(yàn)方法

1.2.2.1菌液制備 將臨床分離的25株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌落接種于M-H平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單菌落用M-H肉湯培養(yǎng)4～6 h，收集細(xì)菌溶于0.9%NaCl注射液并用比濁儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約1×108CFU/mL)，再用M-H肉湯稀釋10倍備用。

1.2.2.2最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定黃連中藥根堿、阿米卡星及頭孢哌酮/舒巴坦的MIC。以200.00 mg/mL黃連中藥根堿、512 μg/mL頭孢哌酮/舒巴坦、1 024 μg/mL阿米卡星作為藥物原液，用M-H肉湯配制成系列濃度：黃連中藥根堿1.56～100.00 mg/mL、頭孢哌酮/舒巴坦4～256 μg/mL、阿米卡星8～512 μg/mL。將各濃度藥液加入25組試管中，除第1管外，每管加入M-H肉湯培養(yǎng)基1.0 mL，然后將待測(cè)菌依次加入含藥管內(nèi)并混勻，每管50 μL，同時(shí)做空白和陽(yáng)性對(duì)照，35 ℃培養(yǎng)12～18 h，觀察結(jié)果，測(cè)定25株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC。MIC范圍為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需藥物的最低濃度范圍；MIC50為使累計(jì)50%的菌株受抑的MIC值；MIC90為使累計(jì)90%的菌株受抑的MIC值。

1.2.2.3聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 以MIC的2倍作為最高濃度，依次對(duì)黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦進(jìn)行對(duì)倍稀釋，每種藥物10個(gè)稀釋濃度，按棋盤設(shè)計(jì)法分別將不同濃度的黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦兩兩組合加入試管中，每種藥物各0.5 mL，輕微振蕩混勻，35 ℃培養(yǎng)12～18 h 后觀察結(jié)果。選擇最佳組合效應(yīng)時(shí)2種藥物聯(lián)用時(shí)各自的MIC，以及單獨(dú)用藥時(shí)的MIC，記錄并計(jì)算分級(jí)抑菌濃度(FIC)指數(shù)。FIC指數(shù)=黃連中藥根堿聯(lián)合的MIC/單獨(dú)的MIC+阿米卡星或頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合的MIC/單獨(dú)的MIC。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)>0.5～1.0為相加作用，F(xiàn)IC指數(shù)>1.0～2.0為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC指數(shù)>2.0為拮抗作用。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行整理分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC及范圍 黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦的MIC均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。黃連中藥根堿分別聯(lián)合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦后，其MIC范圍與3藥單獨(dú)相比保持不變或有所降低，而黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦降低最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、3。

表1 25株鮑曼不動(dòng)桿菌中黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC

表2 黃連中藥根堿、阿米卡星單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC范圍

表3 黃連中藥根堿、頭孢哌酮/舒巴坦單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC范圍

2.2單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC分布情況 單獨(dú)用藥時(shí)，隨著藥物濃度的升高，廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在使用黃連中藥根堿、阿米卡星后的陽(yáng)性菌株比例先升后降，使用頭孢哌酮/舒巴坦后陽(yáng)性菌株比例持續(xù)升高。黃連中藥根堿與阿米卡星，黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥后，陽(yáng)性菌株比例總體上隨著藥物濃度升高而降低。見(jiàn)表4、5。

表4 黃連中藥根堿、阿米卡星單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC與陽(yáng)性菌株分布

2.3相同累計(jì)抑菌率時(shí)單獨(dú)及聯(lián)合用藥濃度的藥物濃度 在累計(jì)抑菌率相同時(shí)，聯(lián)合用藥的藥物濃度較單獨(dú)用藥時(shí)低，其中黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦?jié)舛冉档妥顬槊黠@，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表5 黃連中藥根堿、頭孢哌酮/舒巴坦單獨(dú)及聯(lián)合用藥的MIC與陽(yáng)性菌株分布

表6 相同累計(jì)抑菌率時(shí)黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦單獨(dú)及聯(lián)合用藥的藥物濃度

2.4聯(lián)合用藥時(shí)不同F(xiàn)IC指數(shù)的占比 黃連中藥根堿聯(lián)合阿米卡星聯(lián)合用藥FIC指數(shù)為1.0～<2.0時(shí)占比為72%，以無(wú)關(guān)作用為主；黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦用藥FIC指數(shù)為0.5～<1.0時(shí)占比為72%，以相加作用為主。見(jiàn)表7。

表7 黃連中藥根堿分別聯(lián)合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦用藥的不同F(xiàn)IC指數(shù)占比[n(%)]

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象呈逐年上升趨勢(shì)，其對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗菌藥物均有一定的耐藥性，給臨床抗菌治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[11-12]。對(duì)潛在抗菌藥物進(jìn)行的一項(xiàng)關(guān)于植物源性物質(zhì)的活性研究表明，天然植物的活性化合物可能成為未來(lái)新藥的來(lái)源[13]。一些從草藥中提取的活性化合物顯示出對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和其他革蘭陰性菌具有潛在活性。有研究報(bào)道，從草藥提取物中鑒定出的6種最活躍的化合物之一為來(lái)自黃芩的黃芩苷，幾種清熱解毒的中草藥通過(guò)不同的作用機(jī)制均具有抗炎和抗菌作用[14]。鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)建議，耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的治療主張聯(lián)合用藥[15]。有研究顯示，黃連主要含有多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸、甾體、萜類、黃酮、香豆素、木脂素、異喹啉類生物堿等多種化學(xué)成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗心律失常等藥理活性，其與抗菌藥物聯(lián)合用藥已成為新的探索方向[16]。

帥麗華等[17]研究顯示，黃連提取物與左氧氟沙星聯(lián)合用藥后對(duì)大部分耐藥菌(90.9%)均表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用。吳東美等[18]研究顯示，抗菌藥物、消毒劑(氯己定)和抗菌中藥(黃連)均能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生交叉耐藥，細(xì)菌對(duì)三者的抑菌機(jī)制可能相同。本研究結(jié)果顯示，黃連中藥根堿分別聯(lián)合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦用藥的MIC分布濃度較單獨(dú)用藥有所降低，尤其黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦用藥的MIC分布濃度較單獨(dú)用藥降低最為明顯，表明黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥效果較好。在累計(jì)抑菌率相同時(shí)，聯(lián)合用藥的藥物濃度較單獨(dú)用藥時(shí)低，其中黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦藥物濃度降低最為明顯，表明在相對(duì)較低濃度時(shí)黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦可以取得同等的抑菌效果，其可以減輕患者的抗菌藥物負(fù)擔(dān)。本研究結(jié)果顯示，黃連中藥根堿聯(lián)合阿米卡星用藥16%為相加作用，72%為無(wú)關(guān)作用，12%為拮抗作用，表明黃連中藥根堿與阿米卡星對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外聯(lián)合抑菌作用較弱。而黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦用藥24%為協(xié)同作用，72%為相加作用，4%為無(wú)關(guān)作用，表明黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的體外聯(lián)合抑菌作用較好。有研究顯示，雙黃連聯(lián)合米諾環(huán)素和哌拉西林/他唑巴坦對(duì)廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌多數(shù)表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用和拮抗作用，體外聯(lián)合抑菌作用較差；而雙黃連聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦的體外抑菌作用較好[19]。研究還顯示，頭孢哌酮/舒巴坦具有明顯的抗菌活性[20]。以上研究均都與本研究結(jié)果相一致，機(jī)制可能與干擾細(xì)菌核酸、蛋白等組分合成、抑制細(xì)菌的外排泵等因素有關(guān)。

綜上所述，黃連中藥根堿聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦增強(qiáng)了單獨(dú)用藥(頭孢哌酮/舒巴坦)的抑菌效果，通過(guò)減少頭孢哌酮/舒巴坦的用量可以延緩細(xì)菌耐藥，其體內(nèi)抑菌效果及具體耐藥機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。