Breg細胞與Treg細胞在免疫性血小板減少癥患者外周血中的表達及臨床意義*

郝立君，許 騰，李智偉，楊舒婷，劉紅春

新疆維吾爾自治區人民醫院臨檢中心，新疆烏魯木齊 830001

免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床上較為常見的出血性疾病，屬于自身免疫性疾病，主要是由于自身抗血小板抗體導致血小板破壞增加和血小板生成受到抑制，臨床主要表現為皮膚淤點、淤斑，嚴重者可出現內臟或顱內出血[1]。研究表明，ITP的發生與體液免疫及細胞免疫失調有關[2]，包括自身抗體、B細胞因子、輔助性T細胞(Th)、調節性T細胞(Treg細胞)[3]。B淋巴細胞可以產生血小板抗體，導致血小板破壞增多，同時免疫系統失衡使得相關細胞因子表達出現變化，進一步影響血小板的生成與釋放[4]。目前，關于ITP的免疫調節機制尚不明了，本文通過流式細胞術研究ITP患者治療前后調節性B細胞(Breg細胞)占CD19+細胞的百分比、Treg細胞占CD4+細胞的百分比的變化及與白細胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的相關性，進一步探討以上指標在ITP發病中的免疫調節機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年12月本院血液病科收治的初診患有ITP的住院患者35例為研究對象。35例ITP患者中男性24例，女性11例；年齡25～77歲，年齡中位數(四分位數)[M(P25，P75)]為42(38,62)歲。ITP的臨床診斷符合《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[1]的評分要求，治療前PLT<30×109/L(ITP治療前組)，治療后PLT>50×109/L(ITP治療后組)。選取同期體檢健康者40例作為健康對照組，男性26例，女性14例；年齡24～71歲，年齡38(30,48)歲。ITP患者與體檢健康者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：臨床初診ITP患者；患者自愿參與本試驗并由本人或監護人簽署知情同意書。排除標準：(1)近1個月內接受過激素、丙種球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、免疫抑制劑、化療藥物、血小板生成素受體激動劑等治療；(2)合并血小板降低等其他疾病，如感染、系統性紅斑狼瘡等免疫類疾病，血液或其他系統惡性腫瘤；(3)入院時已輸注血小板進行血象糾正。

1.2儀器與試劑 淋巴細胞分離液(Ficoll)購自美國GE公司；CD38 FITC(333173，HB7)、CD24 APC(656150， ML5)、CD45 PerCP(340385，X40)、CD19 PE(349209，4G7)；CD4 FITC(340039，SK3)、CD127 PE(552543，SB/119)、CD3 PerCP(340298，SK3)、CD25 APC(340938，2A3)流式抗體購自美國BD公司；細胞因子IL-10和TNF-α檢測使用北京曠博公司AimPlex 流式高通量多因子檢測試劑盒及美國BD公司FACS Canto Plus流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1血樣采集 分別采集體檢健康者和ITP患者治療前后外周靜脈血(空腹)兩管，其中一管采用乙二胺四乙酸(EDTA)進行抗凝，采集6 mL用于分離外周血單個核細胞(PBMC)；另一管使用無添加劑采血管采集3 mL離心后取血清轉入EP管，放置于-80 ℃凍存用于IL-10、TNF-α水平檢測。

1.3.2分離PBMC 將6 mL外周血與磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按1∶1的比例稀釋混勻。取6 mL Ficoll于50 mL離心管中，傾斜45°，將稀釋后的血液在Ficoll上方1 cm處沿管壁緩慢加至Ficoll上面。18～20 ℃、2 000 r/min離心30 min后輕輕吸出單個細胞層放入新的離心管中。加入3倍于PBMC體積的PBS，2 000 r/min 離心30 min，重復2次。棄上清液制備成PBMC細胞懸液。

1.3.3流式細胞術檢測Breg細胞和Treg細胞 Breg細胞檢測管吸取100 μL全血，然后加入CD38 FITC 20 μL、CD19 PE 20 μL、CD45 PerCP 20 μL、CD24 APC 5 μL。Treg細胞檢測管吸取100 μL全血，然后加入CD4 FITC 20 μL、CD127 PE 20 μL、CD3 PerCP 20 μL，CD25 APC 5 μL。將檢測管避光放置15 min后加入2 mL紅細胞裂解液，溶血10 min后離心去上清液，再加入2 mL PBS洗滌離心去上清液，加入500 μL PBS，重懸。使用美國BD公司FACS Canto Plus流式細胞儀進行檢測，檢測數據使用FlowJo 10.5進行數據分析，計算Breg細胞占CD19+細胞的百分比和Treg細胞占CD4+細胞的百分比。

1.3.4流式Aimplex法檢測細胞因子IL-10和TNF-α水平 (1)標準品為凍干粉(使用前約4 300 r/min離心10 s)，加入250 μL標準品稀釋液，混勻冰浴5 min，取8聯管(標記1～8)，每管加入120 μL標準品稀釋液，取60 μL標準品原液加入8號管并混勻，由8號管依次轉移60 μL到上一管混勻，直至2號管，1號管加標準品稀釋液作為本底，完成梯度稀釋。(2)從冰箱中取出樣品復融。(3)加入樣品或標準品，每孔45 μL，封板并避光室溫震蕩60 min。(4)用抽濾器抽掉孔內液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(5)加入Biotin-dAb(二抗)，每孔25 μL，封板并避光室溫震蕩30 min。(6)用抽濾器抽掉孔內液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(7)加入藻紅蛋白標記的鏈霉親和素，每孔25 μL，封板并避光室溫震蕩20 min。(8)用抽濾器抽掉孔內液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(9)加入讀數液，每孔150 μL，備用。(10)取剩余微球加入400 μL 讀數液混勻倒入流式管，上機調門框。(11)吹吸各孔內液體使孔內微球懸浮，轉入流式管上機進行檢測。

2 結 果

2.1ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組Breg細胞占CD19+細胞的百分比和Treg細胞占CD4+細胞的百分比比較 與健康對照組比較，ITP治療前組Breg細胞占CD19+細胞的百分比顯著降低，Treg細胞占CD4+細胞的百分比也顯著降低，差異有統計學意義(t=3.855、5.730，均P<0.01)。與健康對照組比較，ITP治療后組Breg細胞占CD19+細胞的百分比顯著降低，Treg細胞占CD4+細胞的百分比也顯著降低，差異有統計學意義(t=2.186、2.037，均P<0.05)。與ITP治療前組比較，ITP治療后組的Breg細胞占CD19+細胞的百分比顯著升高，Treg細胞占CD4+細胞的百分比也顯著升高，差異有統計學意義(t=2.859、5.730，均P<0.01)。見表1和圖1～2。

2.2ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組外周血IL-10、TNF-α水平比較 與健康對照組比較，ITP治療前組外周血IL-10水平顯著降低，而TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(t=6.551、23.90均，P<0.01)。與健康對照組比較，ITP治療后組外周血IL-10水平顯著降低，而TNF-α水平顯著升高，差異有統計學意義(t=2.428、15.62，均P<0.01)。與ITP治療前組比較，ITP治療后組外周血IL-10水平顯著升高，而TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義(t=8.463、12.18，均P<0.01)。見表2。

表1 ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組Breg占CD19+細胞的百分比和Treg細胞占CD4+細胞的百分比比較

表2 ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組外周血IL-10、TNF-α水平比較

注：A表示ITP治療前組；B表示ITP治療后組；C表示健康對照組。

2.3外周血Breg細胞占CD19+細胞的百分比、Treg細胞占CD4+細胞的百分比、IL-10、TNF-α水平的相關性分析 外周血Breg細胞占CD19+細胞的百分比與外周血IL-10水平呈正相關(r=0.763 2，P<0.01)，與TNF-α水平呈負相關(r=-0.647 1，P<0.01)，與外周血Treg細胞占CD4+細胞的百分比呈正相關(r=0.691 7，P<0.01)。見圖3。

注：A表示ITP治療前組；B表示ITP治療后組；C表示健康對照組。

注：A表示Breg細胞占CD19+細胞的百分比與IL-10水平的相關性；B表示Breg細胞占CD19+細胞的百分比與TNF-α水平的相關性；C表示Breg細胞占CD19+細胞的百分比與Treg細胞占CD4+細胞的百分比的相關性。

3 討 論

一般認為ITP發病機制為患者體內產生自身抗血小板抗體，使血小板破壞增多或生成受到抑制。機體免疫狀態失衡是導致ITP進展的關鍵因素，眾多免疫細胞參與其中[5-6]。目前對于ITP的免疫相關研究主要集中于Breg與Treg這兩種調節性細胞[7]。Breg細胞在免疫相關性疾病中對B細胞具有負向免疫調節作用，B細胞在多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、皮肌炎等自身免疫性疾病的發病機制中起重要作用，ITP患者血液中B細胞增殖、分化產生抗體導致血小板破壞增加[8-9]。Breg細胞存在于脾臟中，在B細胞中占比不足1%，具有免疫調節特性[5]，并通過分泌IL-10和轉化生長因子β(TGF-β)發揮免疫調節作用[6]，如果Breg細胞功能減弱或缺失可能引起多種自身免疫性疾病[10]。本研究結果提示，ITP治療前組外周血Breg細胞占CD19+細胞的百分比較健康對照組降低，ITP治療后組外周血Breg細胞占CD19+細胞百分比較ITP治療前組升高，ITP治療后組外周血IL-10水平雖低于健康對照組但顯著高于ITP治療前組，且與Breg細胞占CD19+細胞的百分比呈正相關，提示在ITP疾病中Breg細胞通過分泌IL-10發揮免疫調節作用，抑制免疫反應，延緩甚至改善ITP疾病進展。這與朱世榮等[11]報道的Breg細胞作用于相應的靶向T細胞，通過分泌IL-10發揮免疫抑制作用抑制自身免疫發生的結論一致。

Breg細胞可促進CD4+CD25-T細胞轉化為Treg細胞[12]，本研究中外周血Breg細胞占CD19+細胞的百分比與Treg細胞占CD4+細胞的百分比呈正相關，Breg細胞占CD19+細胞的百分比與IL-10水平亦呈正相關。Breg細胞是IL-10的主要來源，同時可以抑制T細胞增殖并誘導Treg細胞[13-14]，因此，考慮Breg細胞所分泌的IL-10對Treg細胞的生成和維持起重要作用。Treg細胞是一群具有免疫抑制特性的細胞，受Breg細胞調控的同時自身又可分泌IL-10及TGF-β，發揮免疫抑制功能[15]。有研究表明，可能Treg細胞生成減少導致CD4+細胞活化增強，使得IL-2與γ干擾素等細胞因子升高，從而使T淋巴細胞釋放穿孔素殺傷血小板自身抗原，并且能增強單核細胞的吞噬作用，致使血小板破壞增加[11]。本研究數據顯示，ITP治療后組外周血Treg細胞占CD4+細胞的百分比略低于健康對照組，但顯著高于ITP治療前組，因此，恢復Treg細胞功能在治療ITP患者的過程中尤為重要。

TNF-α作為Th1細胞主要分泌的細胞因子類型，在感染性休克、腎移植排斥反應、彌散性血管內凝血、系統性紅斑狼瘡等疾病中起重要作用，在惡性腫瘤發生時能夠一定程度上抑制或殺死腫瘤細胞，但長期表達又可導致腫瘤細胞的惡化[16-17]。IL-10可抑制CD4+T細胞的活化及Th0細胞向Th1和Th2細胞的分化，從而使得TNF-α及IL-4等細胞因子減少，并且誘導效應T細胞的凋亡及調節Th1/Th2平衡，從而抑制自身免疫的發生[11]。本研究中，外周血Breg細胞占CD19+細胞的百分比與TNF-α水平呈負相關，ITP治療后組TNF-α水平雖較健康對照組顯著升高(P<0.05)，但相對于ITP治療前組顯著降低，提示ITP患者體內的T細胞免疫功能紊亂，甚至受到破壞，而該項目能否作為預后判斷指標尚待進一步研究。ITP患者體內同時存在Th1/Th2免疫失衡，但對于是哪一種免疫反應處于主導地位仍存在爭議[18-19]，如果能夠明確其轉化機制并進行干預將有助于疾病的治療。目前對于ITP的主要治療藥物是糖皮質激素、靜脈注射人免疫球蛋白、利妥昔單抗[19]，通過本研究可以推測，細胞因子治療方法能夠為ITP治療提供新的思路。

綜上所述，外周血Breg細胞與Treg細胞在ITP的發生、發展過程中起著重要作用，能通過分泌IL-10等細胞因子抑制T細胞及B細胞活性，Breg細胞又可誘導Treg細胞共同參與ITP患者體內免疫抑制，降低機體自身免疫功能。TNF-α又被IL-10的水平所影響，從而影響疾病進程，有助于臨床診療。ITP屬于免疫缺陷性疾病，研究其免疫調節機制，對于疾病靶向藥物的研制及臨床治療至關重要，同時也為其他自身免疫性疾病的研究奠定了基礎。